WISH and in situ hybridization to cells

In plant cells, the analysis of the gene
expression at the transcription level using
FISH is limited by the cell wall, which makes it
almost impossible for the probes to penetrate
the whole cell,

but just try to cut semithin section of the
pollen tube.

CRT mRNA in pollen grain and pollen tube

Some optical section only will be showed (of all 85)

Image projection

18 S rRNA

18S
rDNA

18S rDNA

FISH on the sections

Whoole cell FISH –
enzymatic
digestion C+P, Triton X
100

18 S rRNA

18 S rRNA

Long 1200 nt
RNA probe

18S
rDNA

DNA oligo
probe 31 nt

Meiocytes

18 S rRNA

18S
rDNA

18S rDNA

18 S rRNA

18 S rRNA

18S
rDNA

CRT mRNA

CRT mRNA

Long 1500 nt
RNA probe

DNA oligo
probe 30 nt

Techniką FISH można identyfikować kilka
różnych sekwencji DNA, stosując różne fluorochromy
emitujące fluorescencję o odmiennej długości fali.

In situ

i in vivo

detekcja of DNA

i RNA:

Inne metody in situ

takie jak np.

in situ nick translacja

In situ PCR

i in situ RT PCR

Wykład:

Współczesne metody badań żywych komórek.

meduza Aequoria victoria

Białko (238 aminokwasów) zostało wyizolowane w latach 60-tych

Gen został sklonowany w 1992 roku

Białka GFP – green fluorescent protein

Białko o strukturze ß – can , w

kształcie cylindra

o średnicy 3 nm i długości 4 nm,

w jego wnętrzu jest struktura

α – heliks

,

natomiast w środku cylindra znajduje się

chlorofor

,

na końcu β-can są

helikalne segmenty

Odporne na denaturację

Mogą być przyłączane do innych białek dzięki
elastyczności końców

Białko GFP zbudowane jest z 238 aminokwasów,

z których   trzy odgrywa zasadniczą rolę w fluorescencji.

Są to

Ser65, Tyr66 oraz Gly67

.

(Czasem seryna zastępowana jest podobną do niej

treoniną

).

Taki tripeptyd można by zapewne znaleźć

w sekwencji  aminokwasowej wielu innych białek,

jednak żadne z nich nie wykazuje zdolności fluorescencyjnych!

Wynika to z faktu, iż grupa chromoforowa   GFP
(

Ser65- dehydroTyr66 – Gly67

) ulega cyklizacji.

Glicyna wiąże się z Seryną tworząc

zamknięty

pierścień

.

Następuje spontaniczna

dehydratacja

.

Tyrozyna   dodatkowo zostaje poddana oksydacji.

Tlen z otaczającego środowiska atakuje wiązania tworzone przez
tyrozynę i uformowane zostają podwójne wiązania tworzące

fluorescencyjny chromofor

.

Dzieje się to w trakcie  

auotoaktywacji chromoforu

, która nie

wymaga obecności żadnych   kofaktorów ani składników
enzymatycznych,
jest jednak wrażliwa na   podwyższenie temperatury.

Najwolniejszym etapem aktywacji, decydującym   o szybkości
całego procesu jest oksydacja tyrozyny trwa około 2 godzin.

Seryna

Tyrozyna

Glicyna

Użyteczne mutanty GFP

• Re-aranżacja genu kodującego GFP pod względem

preferowanych kodonów u ssaków, roślin itp. – ok. 20
krotny wzrost syntezy białek GFP u gospodarza

• GFP mutanty mogą wzbudzane do świecenia w różnych

długościach fali i fluoryzować w różnych kolorach:

daje to możliwość jednoczesnego badania kilku białek

w jednej komórce.

Niektóre mutanty GFP uzyskują znacznie szybszą

formacje fluorofory in tp dziki GFP.

Białko GFP wzbudzane jest światłem o dł. fali 395 – 475 nm

Służą do znakowania białek, a tym samym do

ich zobaczenia w mikroskopie fluorescencyjnym

Gen GFP został   wyizolowany

i stał się powszechnie używanym

narzędziem w biologii   molekularnej.

Problemy związane z nadekspresją białek GFP i białek fuzyjnych:

- toksyczność nadekspresji

- poziom endogennego białka, a białka fuzyjnego,

co właściwie badamy?

Cook i wsp. 2004

GFP fluorescence tagging (B) of actin in Arabidopsis
trichomes (hairs on upper leaf surfaces; SEM shown in
A).

GFP fluorescence tagging (B) of actin in Arabidopsis
trichomes (hairs on upper leaf surfaces; SEM shown in
A).

Królik albinos „Alba”

2000 rok we Francji

Biały z różowymi oczami

488 nm

509 nm

Fuzja małych ciał z większymi

Oddzielenie od większych ciał dwóch
mniejszych

Interakcje pomiędzy dwoma ciałami

Ruchy ciał jądrowych