Kaseta z negatywami
Głowica
z preparatem
Działo elektronowe
Ekran fluorecencyjny
Kamera
Apertura
Apertura
Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)
UTRWALANIE
DEHYDRATACJA
PRZESYCANIE ŻYWICĄ
ZATOPIENIE W ŻYWICY
KROJENIE ULTRACIENKICH SKRAWKÓW
KONTRASTOWANIE
M
M
M
M
szary
srebrny
złoty
purpurowy
niebieski
60
nm
90
150
190
240
nm
nm
nm
nm
skrawki używane do mikroskopu
elektronowego
Rys. Zależność pomiędzy grubością skrawka a jego barwą interferencyjną
SEM of a Flower Spike
Note the great depth of field
Same stereocilia as in previous slide viewed using
Nomarski optics (B) and TEM (C ).
In situ metody pozwalające lokalizować kwasy
nukleinowe.
In situ
i in vivo
detekcja of DNA
i RNA:
Fluorescencyjna
in situ hybrydyzacja
(FISH)
Fluorescencyjne
barwniki takie jak: DAPI,
IP, TOTO
GFP konstrukty białek
związanych z chromatyną
takich jak histony.
In situ i in vivo
eksperymenty z użyciem
BrdU
In situ wykrywanie
transkrypcji z użyciem
BrUTP, Cy3-UTP..
Fluorescencyjna
in vivo hybrydyzacja
(FIVH)
Inne metody in situ
takie jak np.
in situ nick translacja
In situ PCR
i in situ RT PCR
In situ
i in vivo
detekcja of DNA
i RNA:
Fluorescencyjne
barwniki takie jak: DAPI,
IP, TOTO
In situ
i in vivo
detekcja of DNA
i RNA:
Fluorescencyjne
barwniki takie jak: DAPI,
IP, TOTO
Cięcie optyczne
z
x
y
Nucleoli
Mitochondria &
plastids
In situ
i in vivo
detekcja of DNA
i RNA:
In situ i in vivo
eksperymenty z użyciem
BrdU
In situ wykrywanie
transkrypcji z użyciem
BrUTP, Cy3-UTP..
In situ lokalizacja transkrypcji
inkubacja z
Br UTP
- Lupinus luteus
In situ localization of transcription
Br UTP
incubation - Lupinus luteus
In situ localization of transcription
Br UTP
incubation - Lupinus luteus
In situ localization of transcription
Br UTP
incubation - Lupinus luteus
In situ localization of transcription
Br UTP
incubation - Lupinus luteus
Solovei et al.. 2001
In situ
i in vivo
detekcja of DNA
i RNA:
GFP konstrukty białek
związanych z chromatyną
takich jak histony.
In situ
i in vivo
detekcja of DNA
i RNA:
Fluorescencyjna
in situ hybrydyzacja
(FISH)
A whole-mount in situ hybrydyzacja (WISH)
i in situ hybridization w całych komórkach.
In situ hybridization półcienkie skrawki.
Przygotowanie materiału
Półcienkie skrawki
W komórkach roślinnych i zwierzęcych błona komórkowa a w
komórkach roślinnych ściana komórkowa są barierami, które nie
pozwalają na swobodną penetracje przeciwciał do wnętrza
komórki gdzie znajdują się poszukiwane antygeny.
Najczęściej stosowany sposób – uzyskanie półcienkich
skrawków.
Zalety:
*Idealny do badań tkankowych – zachowany układ komórek w
tkance.
Wady:
*Obserwacja tylko fragmentu komórki.
*Pracochłonna technika.
*Możliwość utraty lub zablokowania części antygenów podczas
preparatyki materiału.
Szukana sekwencja
DNA lub RNA
Bufor hybrydyzacyjny
Znakowane sondy
półcienki skrawek
0.1
m – 0.1 mm
Szkiełko podstawowe
Błona komórkowa
Półcienkie skrawki
Półcienkie skrawki
Skrawki paraffinowe
Inne usuwalne
żywice: BMM, PEG,
Technovit.....
Cryo-skrawki
Vibroskrawki
Vibratom:
Skrawki - aż do 100 m (0.1
mm)
Przez kilka minut materiał
„żywy”
a
b
c
wz
ch
n
m
p
m
ł
p
o2
o1
Ovary
Jak dotrzeć do wnętrza komórki: microiniekcja
Kontrast fazowy:
obraz komórki
Podczas iniekcji
przeciwciał.
Permeabilizacja błon komórkowych, izolacja protoplastów:
Permeabelizacja
:
-Detergent (Triton X 100)
-Electroporacja
-Streptolysin O
-Scrape-loading
-Wielokrotne zamrażanie
-Peptidemediated
membrane transfer
Enzymatyczne lub chemiczne trawienie
Ściany komórek roślinnych:
pektynaza, celulaza maceroenzym....
-Żywe komórki pH 5.4-5.8, temp. ~23
O
C
-Komórki utrwalone pH 4.6-4.8, temp. 37
O
C
Hipertonic solution
Plasmolysis of intact plant cells can be
used to facilitate the passage of DNA
Electroporation can then be used to transfer
the macromolecules into plant cells.
Fang-Sheng et al. 2001