Typy znaczników:

Fluorochromy, fluorofory

Typy reakcji:

Reakcje immunocytochemiczne bezpośrednie i pośrednie

Czystość

(specyficzność)

reakcji

immunocytochemicznych:

Blokowanie

Reakcje fałszywie pozytywne

Reakcje kontrolne

Jak dotrzeć do antygenu ?

Półcienkie skrawki

W komórkach roślinnych i zwierzęcych błona komórkowa a w
komórkach roślinnych ściana komórkowa są barierami, które nie
pozwalają na swobodną penetracje przeciwciał do wnętrza
komórki gdzie znajdują się poszukiwane antygeny.

Najczęściej stosowany sposób – uzyskanie półcienkich
skrawków.

Zalety:
*Idealny do badań tkankowych – zachowany układ komórek w
tkance.

Wady:
*Obserwacja tylko fragmentu komórki.
*Pracochłonna technika.
*Możliwość utraty lub zablokowania części antygenów podczas
preparatyki materiału.

antygen

Bufor reakcyjny

Znakowane przeciwciała

półcienki skrawek
0.1



m – 0.1 mm

Szkiełko podstawowe

Błona komórkowa

Półcienkie skrawki

Półcienkie skrawki

Skrawki paraffinowe

Inne usuwalne

żywice: BMM, PEG,

Technovit.....

Cryo-skrawki

Vibroskrawki

Vibratom:

Skrawki - aż do 100 m (0.1

mm)
Przez kilka minut materiał
„żywy”

a

b

c

wz

ch

n

m

p

m

ł

p

o2

o1

zalążnia

Jak dotrzeć do wnętrza komórki: microiniekcja

Kontrast fazowy:
obraz komórki

Podczas iniekcji
przeciwciał.

Hipertoniczny roztwór

Plasmolysis of intact plant cells can be
used to facilitate the passage of DNA

Electroporation can then be used to transfer
the macromolecules into plant cells.

Fang-Sheng   et al. 2001

Permeabilizacja błon komórkowych, izolacja protoplastów:

Permeabelizacja

:

-Detergent (Triton X 100)

-Electroporacja
-Streptolysin O
-Scrape-loading
-Wielokrotne zamrażanie
-Peptidemediated
membrane transfer

Enzymatyczne lub chemiczne trawienie
Ściany komórek roślinnych:
pektynaza, celulaza maceroenzym....

-Żywe komórki pH 5.4-5.8, temp. ~23

O

C

-Komórki utrwalone pH 4.6-4.8, temp. 37

O

C

Mikroskop

Konfokaln

y

Podstawy

Objective

Laser

Emission Pinhole

Excitation Pinhole

PMT

Emission

Filter

Excitation Filter

MRC 1000 System

UV Laser

Kr-Ar Laser

Optical Mixer

Scanhead

Microscope

Scanning Galvanometers

x

y

Laser in

Laser out

Point Scanning

To
Microscope

Cięcie optyczne

z

x

y

z

x

y

z

y

y

3D Rekonstrukcja

x

y

z

y

z

3D Rekonstrukcja

Strumień elektronów

Ultra-

Ultra-

mikrotomi

a

Kaseta z negatywami

Głowica

z preparatem

Działo elektronowe

Ekran fluorecencyjny

Kamera

Apertura

Apertura

Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)