Ćwiczenie
2

Opracowanie:
lek. wet. Jan P. Madej

Materiały do ćwiczeń dla

Wydziału Medycyny

Weterynaryjnej

Testy immunoenzymatyczne
Przeciwciała monoklonalne

Testy fazy stałej:

• test ELISA
• immunoblotting

Test immunoenzymatyczny ELISA

(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Cechy testu ELISA:

• obecność fazy stałej
• wykorzystanie przeciwciał połączonych z enzymem

(AP, HRPO), który powoduje przejście bezbarwnego
substratu w barwny produkt

I etap

opłaszczanie płytki

I etap

opłaszczanie płytki

II etap

blokowanie

I etap

opłaszczanie płytki

II etap

blokowanie

III etap

badany materiał

I etap

opłaszczanie płytki

II etap

blokowanie

III etap

badany materiał

IV etap

przeciwciało koniugowane

z enzymem

I etap

opłaszczanie płytki

II etap

blokowanie

III etap

badany materiał

IV etap

przeciwciało koniugowane

z enzymem

V etap

chromogen

1 – przeciwciało kozy anty-

białka surowicy królika

(etap I przeciwciała)

2 – normalna surowica kozy

Kontrola negatywna:

• dołek F opłaszczony albuminą

• dołek G bez I-go przeciwciała

1:500

1:1500

1:4500

1:13 500 1:13 500

1:40 500 1:40 500

Alb (-)

K (-)

Blank

I etap

opłaszczanie płytki

II etap

blokowanie

III etap

badany materiał

IV etap

przeciwciało koniugowane

z enzymem

V etap

chromogen

Wykrywanie Ab

Wykrywanie Ag

I etap

opłaszczanie płytki

II etap

blokowanie

III etap

badany materiał

IV etap

przeciwciało koniugowane

z enzymem

V etap

chromogen

Najczęstsze niepowodzenia przy przeprowadzaniu testu ELISA

Problem

Proponowane rozwiązanie

1. Absorbancja kontroli z PBS

zamiast

próbki badnej >0.1

Absorbancja kontroli negatywnej

>0.2

l. Zwiększyć liczbę płukań, lepsze blokowanie

(albumina, odtłuszczone mleko, żelatyna itp.

Zwiększyć rozcieńczenie koniugatu lub użyć

koniugat oczyszczony przy pomocy

chromatografii powinowactwa, dodać do buforu

płuczącego 1-5% normalnej surowicy gatunku,

którego przeciwciała są używane do produkcji

koniugatu

2. Absorbancja kontroli wysoce

pozytywnej <0.5

2. Sprawdzić etap opłaszczania, zwiększyć

czystość antygenów lub przeciwciał używanych

do opłaszczania, wydłużyć czas inkubacji

pierwszego przeciwciała lub antygenu,

wprowadzić modyfikacje prowadzące do

amplifikacji systemu

3. Wartości absorbancji próbek

bardziej rozcieńczonych są

wyższe od próbek mniej

rozcieńczonych

3. Zwiększyć rozcieńczenie próbek

4. Wszystkie odczyty poniżej

wartości

0.1

4. Sprawdzić stabilność substratu i buforu,

sprawdzić pH buforu dla substratu, sprawdzić

okres przydatności płytek i koniugatu

5. Wyniki testu nie odpowiadają

stanowi klinicznemu pacjenta

5. Sprawdzić ewentualność występowania

przeciwciał heterofilowych

ZASTOSOWANIE

Wykrywanie przeciwciał przeciwko wirusom:

• enzootycznej białaczki u bydła

• niedokrwistości zakaźnej u koni

• pomoru u świń

• choroby Aujesky u świń

• antygenów wirusa białaczki u kotów

Obejmuje dwa etapy:

• rozdział elektroforetyczny w żelu (PAGE)
• immunochemiczna identyfikacja
antygenów

PAGE – poliacrylamide gel electrophoresis

elektroforeza w żelu poliakrylamidowym

SDS-PAGE – sodium dodecyl sulphat pliacrylamide gel

electrophoresis

elektroforeza w żelu poliakrylamidowym

z dodatkiem siarczanu dodecylu sodu

IMMUNOBLOTTING

Służy do określania ważnych cech Ag

białkowych:

• obecność i ilość Ag

• względny ciężar właściwy łańcuchów polipeptydowych
• stopień oczyszczenia Ag

• szczególnie polecany w pracy nad Ag nierozpuszczalnymi,

trudnymi do znakowania, ulegającymi łatwej degradacji

• określanie obecności, ilości i swoistości przeciwciał z

surowic poliklonalnych oraz ich oczyszczanie

• w połączeniu z metodą immunoprecypitacji – wykrywanie

niewielkich ilości Ag i interakcji pomiędzy antygenami

(Ed. Harlow, D Lane Antibodies. A Laboratory manual,Cold Spring Harbor laboratory, 1988)

Metoda obejmuje następujące

czynności:

• Preparacja próbki antygenu

• Rozdział elektroforetyczny w żelu

• Transfer rozdzielonych antygenów na błonę

np. nitrocelulozową (blotting)

• Blokowanie miejsc nieswoistego wiązania

• Etap przeciwciała

• Detekcja kompleksu antygen przeciwciało

(Ed. Harlow, D Lane Antibodies. A Laboratory manual,Cold Spring Harbor laboratory, 1988)

Aparat do elektroforezy pionowej

http://starklab.slu.edu/Bio104/Plcwest.jpg

http://myrte.u-strasbg.fr/www/Stage_IHC_juin2003-final/CD1-Enseignement/Documents/Photos_stages/2002_juin/_Photos_2002_juin.html

Żel barwiony metodą Coomassie

http://starklab.slu.edu/Bio104/
Plcwest.jpg

http://www-
biology.ucsd.edu/labs/aroian/protocols/sandwich.gif

http://starklab.slu.edu/Bio104/
Plcwest.jpg

OGNISKOWANIE IZOELEKTRYCZNE

IEF

– isoelectric focusing

Polega na rozdziale Ag (najczęściej białek) zgodnie z
ich punktem izoelektrycznym czyli pH, w którym się
zatrzymują.

ELEKTROFOREZA DWUKIERUNKOWA

(two-dimenssional electrophoresis)

Przebiega w 2 etepach:

1. ogniskowanie izoelektryczne (IEF)

2. SDS-PAGE

Przeciwciała monoklonalne

mAb (Monoclonal AntiBodies)

Są to przeciwciała rozpoznające jeden epitop na danym
antygenie, a więc wykazują jednakową swoistość.

Nazwa wywodzi się stąd, że wszystkie takie przeciwciała są
otrzymywane z jednego klonu limfocytów B

Limfocyty pamięci decydują o ilości i klasie

syntetyzowanych przeciwciał

http://www.med.sc.edu:85

(University of South Carolina)

Antygeny są z reguły

wielodeterminantowe

i angażują wiele klonów komórek

do produkcji przeciwciał

Produkcja przeciwciał

monoklonalnych zakłada uzyskanie 1

klonu komórkowego produkującego

przeciwciała skierowane przeciwko 1

determinancie antygenowej

PEG – glikol polietylenowy
HAT – mieszanina hipoksantyny,
aminopteryny i tymidyny

Roitt I., Brostoff J., Male D.: Immunologia 1998

HAT

Cecha

Surowica

poliklonalna

(konwencjonalna)

Przeciwciała monoklonalne

Koncentracja swoistych Ab

0,1 – 1,0 mg/ml

0,5 – 5,0 mg/ml w płynie
otrzewnowym
5,0 – 25 mg/ml w nadsączu z
hodowli

Koncentracja nieswoistych
Ab

10 mg/ml

0,5 – 1,0 mg/ml w płynie
otrzewnowym
BRAK w nadsączu wolnym od
surowicy

Swoistość

przeciw wszystkim
determinantom
antygenowym materiału
użytego do immunizacji

przeciw jednej determinancie
antygenowej materiału użytego do
immunizacji

Powinowactwo

mieszanina przeciwciał o
różnym powinowactwie

stałe – wysokie lub niskie

Aktywność krzyżowa

z reguły występuje

w normalnych warunkach BRAK
jednak nie można całkowicie
wykluczyć

Reakcja precypitacji

TAK

NIE

Klasy i podklasy
immunoglobulin

typowe spektrum

tylko jedna klasa lub podklasa

Właściwości fizykalne

typowe spektrum

indywidualne własności

Neumeier R. Biu7 (1984) 14:97-102

Właściwości surowic odpornościowych

i przeciwciał monoklonalnych

Xenohybrydomy

Funkcja

limf. B

limf. T

Monocyty

Neutrofil

γδ

CD45

przenoszenie sygnału,
różne izoformy
(45R, 45RO, 45RA, 45RB)

(brak u

bydła)

CD14

receptor dla LPS

–

CD2

cząsteczka adhezyjna,
przenoszenie sygnału

–

CD3

przenoszenie sygnału

–

CD4

cząsteczka adhezyjna,
przenoszenie sygnału

–

zwykle

–

zwykle

–

sporadycznie

–

CD5

nieznana

–

CD 8

cząsteczka adhezyjna,
przenoszenie sygnału

–

zwykle

–

sporadycznie

–

CD16

FcγR III

–

CD19

składowa BCR,
przenoszenie sygnału

–

CD21

CR2 – receptor C3d,
składowa BCR

–

po aktywacji

–

CD18

łańcuch β2 integryny

CD11a

LFA-1

CD11b

część Mac-1

subpopul

acje

subpop

ulacje

subpop

ulacje

CD11c

subpopul

acje

subpop

ulacje

subpop

ulacje

głównie

makrofagi

WC1

–

Immunotoksyny

– połączenia przeciwciał monoklonalnych

z toksynami. Koniugaty te po przyłączeniu się do
danego Ag (np. na powierzchni komórki nowotworowej)
mogą niszczyć komórkę niosącą ten antygen. Można
także połączyć toksynę jedynie z częścią zmienną
przeciwciała.

Immunotoksyny

mAb + Leki

Takie koniugaty mogą dostarczać lek bezpośrednio

do chorego miejsca, np. nowotworu (mniejsza
dawka leku, ograniczone efekty uboczne leku –
ważne w chemioterapii)

mAbs +

izotopy

• umożliwiają lokalne "naświetlenie" komórek

nowotworowych (zmniejszenie dawki promieniowania
oraz bardziej precyzyjne naświetlenie)

• zwalczenie małych skupisk tk. nowotworowych, które

nie mogą być wykryte

• przy pomocy detektorów promieniowania -

diagnostyka miejsc występowania przerzutów

Abzymy

Są to przeciwciała o możliwościach katalitycznych,

które mogą przeprowadzić substrat w produkt
poprzez

związek

pośredni,

analogicznie

enzymów. Abzymy otrzymuje się z przeciwciała
monoklonalnego przeciwko antygenowi podobnemu
do stadium przejściowego reakcji enzymatycznej.

Są o wiele mniej skuteczne od enzymów, ale prawdopodobnie znajdą

zastosowanie w katalizie niespotykanych w przyrodzie reakcji

Przeciwciała o podwójnej

swoistości

• mogą reagować z dwoma różnymi antygenami
• sprzężeniu ze sobą dwóch kompletnych

przeciwciał monoklonalnych

• zastosowanie w leczeniu nowotworów - jedna

część przeciwciała łączy się z komórką
nowotworową, druga zaś z limfocytem T.

Przeciwciała chimeryczne i

"uczłowieczone"

Przeciwciała chimeryczne

- większość łańcucha

polipeptydowego stanowi białko ludzkie,
natomiast część zmienna lub jej najważniejsze
fragmenty są pochodzenia mysiego

Jeśli wymienione zostały tylko regiony

hiperzmienne, to takie przeciwciała nazywamy

"uczłowieczonymi"

(ang. humanized antibody)

Zastosowanie przeciwciał

monoklonalnych

• w terapii nowotworów

– np. Mylotarg używany w

leczeniu ostrej białaczki szpikowej i będący
koniugatem mAb anty-CD33 ze złożonym
oligosacharydem indukującym rozcinanie DNA.

• immunosupresja w transplantologii

– możliwość

wybiorczego hamowania odpowiednich subpopulacji
limfocytów

• immunosupresja w chorobach o podłożu zapalnym

–

Ab skierowane przeciwko cytokinom wywołującym
patologię

• blokowanie krzepnięcia krwi

– blokowanie

receptorów płytek wiążących się z fibrynogenem (u
pacjentów po angioplastyce)

• neutralizacja toksyn

– lepsza od stosowania

surowic (np. w leczeniu tężca), gdyż pacjenta nie
obciąża się balastem białkowego w postaci białek
surowicy obcego gatunku

• badania diagnostyczne

w laboratorium

analitycznym (testy ELISA i RIA)

• oczyszczanie różnych substancji na kolumnach

opłaszczonym mAb

Główne problemy terapii z użyciem

mAb

• Reakcja odpornościowa ludzkiego organizmu

Ze względu na trudność w pozyskaniu i hodowli
ludzkich linii szpiczakowych oraz etyczne przeszkody
w immunizacji ludzi do fuzji używa się komórek
mysich.

• Immunotoksyny

mogą przypadkowo uszkadzać inne

komórki organizmu, nie tylko te, które są ich celem.

Stosuje się także immunotoksyny bazujące na przeciwciałach o
podwójnej swoistości, przeciwko np. dwóm różnym antygenom
nowotworowym.

• powolna migracja do tkanek

(mAb są dużymi

cząsteczkami). Problem ten jest rozwiązywany przez
próby wiązania toksyn i leków z samymi częściami
zmiennymi przeciwciał.

• duże koszty otrzymania