REAKCJA ANTYGEN-PRZECIWCIAŁO (Ag-Ab)
-w reakcji Ag-Ab antygen może być substancją rozpuszczoną w roztworze, związaną z komórką lub sztucznym nośnikiem. W zalezności od tego rozróżniamy:
reakcję precypitacji- antygen staje się widoczny i precypituje w przebiegu reakcji
reakcję aglutynacji- komórki lub cząstki nośnika łączą się ze sobą- „aglutynują” w wyniku reakcji
Oprócz tych 2 istnieje wiele innych reakcji, w których skutki mają odmienny charakter, np. połączenie antygenu z przeciwciałem może manifestować się wiązaniem układu dopełniacza (komplementu) lub neutralizacją toksyn bakteryjnych, lizą komórek, ułatwieniem fagocytozy itp.
połączenie to może tez nie dawać żadnych widocznych skutków fizycznych czy biologicznych. Wykrywa się je wtedy przez detekcję znacznika, np. izotopu czy enzymu, związanego celowo z jednym ze składników reakcji
REAKCJA PERCYPITACJI
zachodzi między przeciwciałem a rozpuszczalnym w wodzie antygenem o masie cząsteczkowej 40-160 KD
percypitat (strąt) powstaje wskutek utworzenia sieci przestrzennej zawierającej wiele połączonych cząsteczek antygenu i przeciwciał, przy czym w reakcji biorą udział różne determinanty antygenowe z różnymi przeciwciałami
przebieg percypitacji zależy od:
stężenia składników (Ab, Ag)
czasu zetknięcia
temperatury
stężenia elektrolitów
antygen i przeciwciało mają zdolnośc dyfuzji w różnych nośnikach, co ułatwia kontrolowany kontakt i reakcję obu składników
do nośników tych należą:
bibuły filtracyjne
błony syntetyczne np. octan celulozy, nitroceluloza, skrobia, pewikon (związek krzemu)
metody percypitacji w żelu (agarowym lub agarozowym) polegają na tworzeniu wyraźnego, opalizującego prążka percypitatu w strefie bliskiej rónowagi moelkularnej (sterfie ekwiwalencji) antygenu i przeciwciała, widocznego w bezbarwnym żelu
METODY JAKOŚCIOWE
1.Reakcja precypitacji w roztworze
-dotyczy antygenów wielodeterminantowych i co najmniej 2 wartościowych przeciwciał rozpuszczonych w roztworze
-słabe siły, niekowalencyjne, utrzymują kompleks immunologiczny
-większość kompleksów Ab-Ag zależy od stosunku stężeń obu składników,
- ilość składników ma wpływ na strukturę powstających kompleksów
-gdy rosnące stężenia antygenu dodaje się do stałej ilości przeciwciał, ilość tworzonych kompleksów immunologicznych rośnie, a następnie maleje. Powstała w ten sposób krzywa Heidelberga ma 3 strefy:
strefa nadmiaru przeciwciał :ilość antygenu jest zbyt mała ,aby przereagować i wytrącić wszystkie przeciwciała , w nadsączu obecne wolne przeciwciała
strefa równowagi(ekwiwalencji): ilość antygenu jest wystarczająca ,aby przereagować i wytrącić wszystkie przeciwciała , w nadsączu brak wolnych przeciwciała i wolnego antygenu, tworzą się makromolekuły-max. efekt zmętnienia
strefa nadmiaru antygenu : ilość antygenu przewyższa ilość wymaganą do wytrącenia wszystkich przeciwciał, zmniejsza się ilość kompleksów -rozpadają się one w nadmiarze antygenu( konkurencja o miejsce w przeciwciałach)
2.Reakcje precypitacji w żelu: podwójna dyfuzja wg Ouchterlony'ego
-umożliwia rozróżnienie reakcji antygenu z różnymi przeciwciałami obecnymi w surowicy(surowica poliwalentna-reaguje z wieloma antygenami) - odczyn podwójnej dyfuzji w żelu
-na szklaną płytkę wylewa się 1% agarozę w buforze o pH 7,0-8,5. w zastygłym żelu agarozowym wycina się studzienki, w których umieszcza się roztwory Ab i poszukiwanych Ag. Po umieszczeniu płytki w wilgotnej komorze, białka dyfunndują w żel i w miejscu ich spotkania powstaje linia percypitacyjna.
-czas:10-12h
-w wyniku reakcji powstaje linia precypitacyjna, jeśli zostanie zachowany warunek równowagi
-położenie linii zależy od stężeń składników lub wielkości cząsteczek
-możliwość badania relacji miedzy przeciwciałami (testy identyczności wobec tego samego przeciwciała)
identyczność: łagodne przejście -łuki precypitacyjne wytworzone pomiędzy przeciwciałem a 2 Ag łączą się - Ab precypituje identyczne epitop w każdym z 2 testowanych Ag
brak identyczności: Ab rozróżnia 3 różne antygeny tworzące niezależne linie, wieksze Ag dyfunduja wolniej
częściowa identyczność: ostroga + linia identyczności - Ag maja wspólny 1 epitop,a dodatkowo jeden z nich ma 2 epitop
-zastosowanie: diagnostyka białek w moczu
-czułość metody: 20µg/ml - 2mg/ml
3.Immunoelektroforeza (elektroimmunodyfuzja)
-zastosowanie:gdy dużo antygenów w mieszaninie
-przed uwidocznieniem reakcji na drodze precypitacji antygeny rozdziela się w oparciu o ich ładunek elektryczny (elektroforeza)
-antygeny ze studzienek wyciętych w zelu sa rozdzielane w polu elektrycznym
-pH żelu jest wysokie (8,6-8,8), dzięki czemu białka naładowane + wędrują do elektrody -, a białka do elektrody +
-pomiędzy studzienkami wycina się w żelu rowek- równoległy do kierunku migracji i wypełnia się go surowicą z przeciwciałami skierowanymi przeciwko poszukiwanym antygenom
-Ab i Ag dyfunduja do żelu i tworza łuki percypitacyjne odpowiadajace poszczególnym antygenom w ykrytym w mieszaninie
- zastosowanie: diagnozowanie niedoborów odpornościowych, gammapatii (podwyższonych stężeń Ig) i innych zaburzeń składu białek w płynach ustrojowych
-miano surowicy- najniższe stężenie surowicy odpornościowej, które daje jeszcze widoczną reakcję precypitacji dla małego stężenia antygenu
immunoelektroforeza przeciwprądowa- technika żelowa, w której antygen i przeciwciało wędrują do siebie w polu elektrycznym z 2 oddzielnych kubełków. Jest metodą bardzo szybką (ok.30min.) i czulszą 10 razy od PDA.
Zastosowanie: diagnostyka chorób zakaźnych, wykrywanie antygenów grzybiczych i bakteryjnych oraz antygenów wirusowych zapalenia wątroby Hbs
immunoelektroforeza krzyżowa- pozwala na identyfikację Ag wystepującego w małych ilościach w mieszaninie białek.
etap 1-taki jak w immunoelektroforezie
etap 2- po wyjęciu płytki z aparatu, dolewa się agarozę zawierającą przeciwciała przeciwko poszukiwanym antygenom. Drugi rozdział przeprowadza się w kierunku prostopadłym do pierwszego.
Antygeny wędrując przez żel spotykaja na swej drodze unieruchomione przeciwciała, tworząc najpierw migrujące kompleksy, a później w strefie ekwiwalencji, łuki percypitacyjne
metoda b.czuła, pozwala na wykrycie i ocenę (też ilościową) białek występujących w b. małych ilościach w roztworze
zastosowanie: analizy polimorfizmu i mikroheterpgenności białek, identyfikacja alergenów zdolnych do swoistego wiązania IgE z surowicy chorych
4. Immunofiksacja
zastosowanie jak immunoelektroforeza, ale czulsza i szybsza (ok.2h)
po rozdziale elektroforetycznym, białka są lokalizowane w żelu za pomocą monospecyficznych przeciwciał (żel pokrywa się warstwą bibuły nasączonej roztworem przeciwciał)
unieruchomione w agarozie kompleksy Ab-Ag wybarwia się np. błękiitem kumasyny
Metody ilościowe
1.Immunodyfuzja radialna
-pozwala na ilościowa ocenę reakcji i antygenów
-Ab dodaje się do żelu przed jego zestaleniem na szkiełku
-do wyciętych w żelu studzienek dodaje się te same obj. standardu o różnych stężeniach i badanych próbek
-24h inkubacja
-Ag dyfunduje tworząc kompleksy az do ustalenia się stanu równowagi, co ujawnia się powstaniem pierścienia precypitacji
-pole krążka(d²) jest proporcjonalne do stężenia antygenu
-wartości nieznane odczytuje się z krzywej standardowej
2.Elektroforeza przeciwprądowa
-wykonuje się w żelu, którego pH jest tak dobrane, aby Ab miało ładunek dodatni Ag ujemny
-jest to możliwe w większości wypadków, bo Ab maja stosunkowo wysoki punkt izoelektryczny ( są obojętne w bardziej zasadowym pH niż większość Ag)
-gdy ładunki antygenu i przeciwciała nie różnią się wystarczająco, można dokonać modyfikacji chemicznej aby zmianie ich punkt izoelektryczny
-po umieszczeniu w polu elektrycznym Ag i Ab zbliżają się do siebie i powstaje precypitat
-czułość:10-20 razy wyższa niż w podwójnej precypitacji
3.Elektroeforeza rakietowa
-ilościowa metoda elektroforetyczna w obecności specyficznych przeciwciał znajdujących się w żelu
-pozwala na oznaczenie stężenia Ag dokonując jego elektroforezy w żelu zawierającym Ab
-odpowiednio dobrane pH sprawia ze Ab nie mają ładunku, a Ag ma ładunek ujemny
-tworzące się precypitaty mają kształt rakietek, w których wysokość jest proporcjonalna do stężenia antygenu
-wartości badanych próbek oblicza się z krzywej standardowej
4.Metoda nefelometrii
-ocenia stężenie r-ru powstałe w wyniku reakcji miedzy Ag a specyficznym Ab
-ocenia osłabienie wiazki świetlnej po przejściu przez roztwór
-ocenia stopień rozproszenia wiązki świetlnej (detektory nastawione miedzy 45º-90º)
- metoda analizy stężenia lub składu molekularnego roztworu na podstawie pomiaru natężenia światła rozproszonego przez zawiesinę.
- wykorzystywany jest efekt Tyndalla
-zalety: szybka, jednostopniowa
-przy małych stężeniach, niskocząsteczkowe kompleksy
-stosuje się krzywą standardową