Izolacja wirusów przy

pomocy tkanek i komórek

dr n. wet. Łukasz Adaszek

Klinika Chorób Zakaźnych

Cele hodowli

• Namnażanie wirusów do dla diagnostyki

chorób.

• Badanie zmian patologicznych

wywoływanych przez wirusy w narządach

• Namnażanie wirusów do dla potrzeb

szczepionek

• Uzyskiwanie czystych hodowli wirusowych

Trudności w prowadzeniu

hodowli

• Wysoki koszt odczynników
• Konieczność odpowiedniego

laboratorium

• Konieczność stworzenia

odpowiednich warunków in vitro do
wzrostu i namnażania wirusów

Namnażanie wirusów w

hodowlach komórkowych

• Dobór hodowli uzależniony jest od jej

wrażliwości na dany wirus.

• Dawkę zakaźna wyróżnia się w

jednostkach:

TCID

50-

50%

dawka zakaźna dla hodowli

komórek. Takie rozcieńczenie wirusa,
które wywołuje efekt cytopatyczny w
50% zakażonych hodowlach

Namnażanie wirusów w

hodowlach komórkowych

PFU-(plaque forming unit)-jednostka

łysinkowa)-najwyższe rozcieńczenie
wirusa wywolujace zniszczenie
hodowli komórek w postaci łysinek.

MOI- multiplicity of infection- liczba

cząstek wirusa przypadająca na
komórkę.

PFU-unit

MOI

Namnażanie wirusów w

hodowlach komórkowych

• Replikacja wirusa zachodzi tylko w

komórkach wrażliwych

• Wirus w hodowli przechodzi wszystkie

stadia zakażenia, tak jak w organizmie
żywym tj. adsorpcja, penetracja, i
uwalnianie potomnych cząstek wirusa.

Namnażanie wirusów w

hodowlach komórkowych

• Wirusy w komórkach mogą wywoływać

zmiany prowadzące do:

1.

Efektu cytopatycznego- uszkodzenie

funkcji komórek z charakterystycznymi

zmianami morfologicznymi widzianymi

w mikroskopie świetlnym.

2.

Zakażenia persystentnego nie

powodującego śmierci komórki. Część

komórek hodowli pozostaje

niezakażona.

Namnażanie wirusów w

hodowlach komórkowych

3. Transformacji komórek- np. pod

wpływem retrowirusów.
transformacja może wiązać się z
integracją genomu wirusa do
genomu komórki bez replikacji
wirusa, lub może być zachowane
tworzenie się zakaźnych wirionów.

Efekt cytopatyczny

• nieodwracalne, uszkodzenie i

zniszczenie komórki w wyniku
zaburzeń metabolizmu komórkowego,
działania białek wirusa i nowo
zsyntetyzowanych wirusów.

• Objawia się on zatrzymaniem ruchu

komórek, podziałów oraz syntezy DNA
i białek komórkowych., wakuolizacją
cytoplazmy, dezintegracją jądra itp..

Efekt cytopatyczny

• najczęściej jest on charakterystyczny

dla określonej grupy wirusów.

• adsorpcja wirusów może wywołwać

zmiany w przepuszczalności błonuy
komórkowej i nie pozwalać na
wnikanie np. rybonukleotydów-
zahamowanie syntezy RNA i
obumarcie komórki

Efekt cytopatyczny

• adenowirus typu 5 wywołuje efekt

cytopatyczny już po 12 h od
zakażeniea hodowli inne wirusy
różnie.

• przy zakażeniach herpeswirusami

powstają syncytia-komórki olbrzymie

Syncytia

Efekt cytopatyczny

• syncytia powstają ns uszkodzenia lipidów

błony komórkowej

• mogą być s. wczesne-złożone tylko z

komórek zainfekowanych

• lub późne złożone z komórek zakażonych i

zdrowych.

• Do zniszczenia komórek może dochodzić

ns. masowego uwalniania potomnych

wirusów z błony jądrowej, aparatu

Golgiego, retikulum endoplazmatycznego

Wtręty komórkowe

• odmiana efektu cytopatycznego
• mogą pojawiać się w jądrze

komórkowym (opryszczka),
cytoplazmie (ospa) lub w obu
miejscach (odra)

• są to skupiska replikujących wirusów

lub pozostałości po namnażaniu się
wirusa

Wtręty komórkowe

Są 2 rodzaje wtrętów wewnątrzjądrowych:
• wtręty A powstaja w jadrach i są wyraźnie

odgraniczone od chromatyny (herpes, ch.

Aujeszky, ospa wietrzna)

• wtręty B (wirus żółtej febry) są

niewyraźnie odgraniczone od chromatyny

• wtręty wewnątrzcytoplazmatyczne

(nosówka- ciałka Lentza, wścieklizna –

Babesa –Negriego)

Abberacja chromosomów

• jest to zmiana kariotypy komórek w

następstwie infekcji wirusem.

• najczęściej ma charakter losowy i

dotyczy translokacji, pęknięć
chromosomów

• wywoływany przez wirus różyczki,

cytomegalii (poronienia i wady u
dzieci)

Transformacje komórek

• Powstają najczęściej pod wpływem

wirusów onkogennych.

• zakażone komórki nabywają nowych

cech biologicznych

• na ogół nie dochodzi do śmierci

komórek

• ale ich wzrost jest chaotyczny,

wielowarstwowy, zmienony jest ich
metabolizm i morfologia

Transformacje komórek

• zmniejszają się wymagania życiowe
• zwiększa się przemiana cukrowa,

produkcja kwasów organicznych

• wykazuje się także nieprawidłowości

w chromosomie

Zwierzęta doświadczalne

Izolacja wirusów na zwierzętach

laboratoryjnych wymaga:

• wyboru odpowiedniego zwierzęcia

modelowego

• wprowadzenia wirusa do organizmu

odpowiednią drogą.

• wadą badania jest możliwość ujawniania się u

zwierząt zakażanych infekcji bezobjawowych

z charakterystycznymi objawami, które mogą

zmniejszać wrażliwość organizmu na badany

wirus (zjawisko interferencji)

Zwierzęta doświadczalne

• dlatego najlepiej badanie to

przeprowadzać na hodowlach zwierząt
wolnych od zarazków-germ free.

• Najczęściej zwierzęta zakaża się

podskórnie, donosowo, domózgowo,
dożylnie i dootrzewnowo.

• postępowanie ze zwierzętami reguluje

ustawa o ochronie zdrowia zwierząt

Zakażenie dootrzewnowe

Zakażenie dożylne

Zakażenie podskórne

LD 50

• LD 50 (lethal dose)- jest to takie

rozcieńczenie badanego wirusa, które
wywołuje śmierć 50% zakażanych
zwierząt.

Zarodki ptasie

• testowane są na nich wirusy, na które

osobniki dorosłe mogą być odporne.

• służą także do przygotowania wirusów

szczepionkowych

• różne drogi zakazania: do worka

żółtkowego, do jamy omoczniowej, do

jamy owodniowej, na błonę

kosmówkowo-omoczniową-konieczna

znajomość anatomii jaja

Zarodki ptasie

• Jaja przed inokulacją oświetlamy

celem określenia położenia zarodka

• otwór w skorupie wykonujemy po

wcześniejszej jej dezynfekcji.

• zakażone jaja inkubujemy w 37°C ,

wilgotność 62%

• zrodki zakaża się najczęściej w wieku

5-14 dni

Zarodki ptasie

• zarodki które giną 16-24 godziny po

zakażeniu usuwa się, gdyż przyczyną
ich śmierci nie jest wirus, lecz
najczęściej uraz mechaniczny, do
którego doszło w czasie zakażania.

• 2-5 dni p.i. wzrost wirusa może być

wykazany na podstawie: śmierci
zarodka, tworzenia się zmian w
strukturach jaja.

Zarodki ptasie

• wirus otrętu, BHV-1, choroby

cieszyńskiej oraz biegunki bydła nie
udało się zaadoptować do zarodków
kurzych

• EID 50- jest to takie rozcieńczenie

badanego wirusa, które wywołuje
śmierć 50% zakażanych zarodków.