Izolacja wirusów przy 

pomocy tkanek i komórek

dr n. wet. Łukasz Adaszek

Klinika Chorób Zakaźnych

 

 

Cele hodowli

• Namnażanie wirusów do dla diagnostyki 

chorób.

• Badanie zmian patologicznych 

wywoływanych przez wirusy w narządach

• Namnażanie wirusów do dla potrzeb 

szczepionek

• Uzyskiwanie czystych hodowli wirusowych

 

 

Trudności w prowadzeniu 

hodowli

• Wysoki koszt odczynników
• Konieczność odpowiedniego 

laboratorium

• Konieczność stworzenia 

odpowiednich warunków in vitro do 
wzrostu i namnażania wirusów

 

 

 

 

Namnażanie wirusów w 

hodowlach komórkowych

• Dobór hodowli uzależniony jest od jej 

wrażliwości na dany wirus.

• Dawkę zakaźna wyróżnia się w 

jednostkach:

TCID

50-

 

50%

 

dawka zakaźna dla hodowli 

komórek. Takie rozcieńczenie wirusa, 
które wywołuje efekt cytopatyczny w 
50% zakażonych hodowlach

 

 

Namnażanie wirusów w 

hodowlach komórkowych

PFU-(plaque forming unit)-jednostka 

łysinkowa)-najwyższe rozcieńczenie 
wirusa wywolujace zniszczenie 
hodowli komórek w postaci łysinek.

MOI- multiplicity of infection- liczba 

cząstek wirusa przypadająca na 
komórkę.

 

 

PFU-unit

 

 

MOI

 

 

Namnażanie wirusów w 

hodowlach komórkowych

• Replikacja wirusa zachodzi tylko w 

komórkach wrażliwych

• Wirus w hodowli przechodzi wszystkie 

stadia zakażenia, tak jak w organizmie 
żywym tj. adsorpcja, penetracja,  i 
uwalnianie potomnych cząstek wirusa.

 

 

 

 

Namnażanie wirusów w 

hodowlach komórkowych

• Wirusy w komórkach mogą wywoływać 

zmiany prowadzące do:

1.

Efektu cytopatycznego- uszkodzenie 

funkcji komórek z charakterystycznymi 

zmianami morfologicznymi widzianymi 

w mikroskopie świetlnym.

2.

Zakażenia persystentnego nie 

powodującego śmierci komórki. Część 

komórek hodowli pozostaje 

niezakażona.

 

 

Namnażanie wirusów w 

hodowlach komórkowych

3. Transformacji komórek- np. pod 

wpływem retrowirusów. 
transformacja może wiązać się z 
integracją genomu wirusa do 
genomu komórki bez replikacji  
wirusa, lub może być zachowane 
tworzenie się zakaźnych wirionów.

 

 

Efekt cytopatyczny

• nieodwracalne, uszkodzenie i 

zniszczenie komórki w wyniku 
zaburzeń metabolizmu komórkowego, 
działania białek wirusa i nowo 
zsyntetyzowanych wirusów.

• Objawia się on zatrzymaniem ruchu 

komórek, podziałów oraz syntezy DNA 
i białek komórkowych., wakuolizacją 
cytoplazmy, dezintegracją jądra itp..

 

 

 

 

 

 

 

 

Efekt cytopatyczny

• najczęściej jest on charakterystyczny 

dla określonej grupy wirusów.

• adsorpcja wirusów może wywołwać 

zmiany w przepuszczalności błonuy 
komórkowej i nie pozwalać na 
wnikanie np. rybonukleotydów-
zahamowanie syntezy RNA i 
obumarcie komórki

 

 

Efekt cytopatyczny

• adenowirus typu 5 wywołuje efekt 

cytopatyczny już po 12 h od 
zakażeniea hodowli inne wirusy 
różnie.

• przy zakażeniach herpeswirusami 

powstają syncytia-komórki olbrzymie

 

 

Syncytia

 

 

 

 

 

 

Efekt cytopatyczny

• syncytia powstają ns uszkodzenia lipidów 

błony komórkowej

• mogą być s. wczesne-złożone tylko z 

komórek zainfekowanych

• lub późne złożone z komórek zakażonych  i 

zdrowych.

• Do zniszczenia komórek może dochodzić 

ns. masowego uwalniania potomnych 

wirusów z błony jądrowej, aparatu 

Golgiego, retikulum endoplazmatycznego

 

 

Wtręty komórkowe

• odmiana efektu cytopatycznego
• mogą pojawiać się w jądrze 

komórkowym (opryszczka), 
cytoplazmie (ospa) lub w obu 
miejscach (odra)

• są to skupiska replikujących wirusów 

lub pozostałości po namnażaniu się 
wirusa

 

 

 

 

 

 

Wtręty komórkowe

Są 2 rodzaje wtrętów wewnątrzjądrowych:
• wtręty A powstaja w jadrach i są wyraźnie 

odgraniczone od chromatyny (herpes, ch. 

Aujeszky, ospa wietrzna)

• wtręty B (wirus żółtej febry) są 

niewyraźnie odgraniczone od chromatyny

• wtręty wewnątrzcytoplazmatyczne 

(nosówka- ciałka Lentza, wścieklizna –

Babesa –Negriego) 

 

 

Abberacja chromosomów

• jest to zmiana kariotypy komórek w 

następstwie infekcji wirusem.

• najczęściej ma charakter losowy i 

dotyczy translokacji, pęknięć 
chromosomów

• wywoływany przez wirus różyczki, 

cytomegalii (poronienia i wady u 
dzieci)

 

 

 

 

Transformacje komórek

• Powstają najczęściej pod wpływem 

wirusów onkogennych.

• zakażone komórki nabywają nowych 

cech biologicznych

• na ogół nie dochodzi do śmierci 

komórek

• ale ich wzrost jest chaotyczny, 

wielowarstwowy, zmienony jest ich 
metabolizm i morfologia

 

 

Transformacje komórek

• zmniejszają się wymagania życiowe
• zwiększa się przemiana cukrowa, 

produkcja kwasów organicznych

• wykazuje się także nieprawidłowości 

w chromosomie 

 

 

 

 

Zwierzęta doświadczalne

Izolacja wirusów na zwierzętach 

laboratoryjnych wymaga:

• wyboru odpowiedniego zwierzęcia 

modelowego

• wprowadzenia wirusa do organizmu 

odpowiednią drogą.

• wadą badania jest możliwość ujawniania się u 

zwierząt zakażanych infekcji bezobjawowych 

z charakterystycznymi objawami, które mogą 

zmniejszać wrażliwość organizmu na badany 

wirus (zjawisko interferencji)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Zwierzęta doświadczalne

• dlatego najlepiej badanie to 

przeprowadzać na hodowlach zwierząt 
wolnych od zarazków-germ free.

• Najczęściej zwierzęta zakaża się 

podskórnie, donosowo, domózgowo, 
dożylnie i dootrzewnowo.

• postępowanie ze zwierzętami reguluje 

ustawa o ochronie zdrowia zwierząt 

 

 

Zakażenie dootrzewnowe

 

 

Zakażenie dożylne

 

 

Zakażenie podskórne

 

 

LD 50

• LD 50 (lethal dose)- jest to takie 

rozcieńczenie badanego wirusa, które 
wywołuje śmierć 50% zakażanych 
zwierząt.

 

 

Zarodki ptasie

• testowane są na nich wirusy, na które 

osobniki dorosłe mogą być odporne.

• służą także do przygotowania wirusów 

szczepionkowych

• różne drogi zakazania: do worka 

żółtkowego, do jamy omoczniowej, do 

jamy owodniowej, na błonę 

kosmówkowo-omoczniową-konieczna 

znajomość anatomii jaja

 

 

 

 

Zarodki ptasie

• Jaja przed inokulacją oświetlamy 

celem określenia położenia zarodka

• otwór w skorupie wykonujemy po 

wcześniejszej jej dezynfekcji.

• zakażone jaja inkubujemy w 37°C , 

wilgotność 62%

• zrodki zakaża się najczęściej w wieku 

5-14 dni 

 

 

Zarodki ptasie

• zarodki które giną 16-24 godziny po 

zakażeniu usuwa się, gdyż przyczyną 
ich śmierci nie jest wirus, lecz 
najczęściej uraz mechaniczny, do 
którego doszło w czasie zakażania.

• 2-5 dni p.i. wzrost wirusa może być 

wykazany na podstawie: śmierci 
zarodka, tworzenia się zmian w 
strukturach jaja.

 

 

 

 

 

 

Zarodki ptasie

• wirus otrętu, BHV-1, choroby 

cieszyńskiej oraz biegunki bydła nie 
udało się zaadoptować do zarodków 
kurzych

• EID 50- jest to takie rozcieńczenie 

badanego wirusa, które wywołuje 
śmierć 50% zakażanych zarodków.