Barwienie rozmazu krwi

Często stosowane są barwniki takie jak Wrighta lub

Wrighta-Giemsy .
Są barwnikami polichromicznymi ponieważ zawierają dwie

składowe: eozynę i błękit metylenowy
Zawarty w nich metanol utrwala komórki i przykleja do

szkiełka.
Bufor ułatwia wybarwianie
Barwienie jest zależne od pH.

Błekit metylenowy ma zasadowe pH i wybarwia

kwaśne elementy komórki jak RNA i DNA.

Eozyna jest kwaśna i wybarwia zasadowe

komponenty komórek jak hemoglobinę czy

ziarnistości eozynofilowe.

Różnicowe liczenie krwinek

białych

Wykrywanie zmian w liczebności cyrkulujących
białych krwinek (WBC) . Ocena procentowości.
Niezbędne w ocenie infekcji, zatruć, leukemii, zakażeń
pasożytniczych, reakcji alergicznych i podczas
chemioterapii.

Normalna liczba białych krwinek:



neutrofile 60-70% (podwyższona w infekcjach
bakteryjnych)



limfocyty 20-25% (podwyższona w infekcjach
wirusowych)



monocyty 3 -- 8 % (podwyższona w
grzybiczych/wirusowych infekcjach )



eozynofile 2 -- 4 % (podwyższona w zakażeniach
pasożytniczych i w alergii)



bazofile <1% ( podwyższone w reakcjach alergicznych.)

Eozynofile

Neutrofile

Monocyty

Monocyty

mały

Średni

duży

Limfocyty

Dr Barbara

Dr Barbara

Szkudlińska

Szkudlińska

Chemotaksj

a

Fagocytoza

Test NBT

CHEMOTAKSJA

CHEMOTAKSJA

Ukierunkowany ruch komórek ( np.
granulocyty, monocyty, makrofagi )
stymulowany gradientem czynnika
chemotaktycznego.

CZYNNIKI CHEMOTAKTYCZNE

CZYNNIKI CHEMOTAKTYCZNE

Egzogenne

:

antygeny i metabolity bakterii ( f-
MLP, peptydoglikany, LPS), kazeina

Endogenne

:

- pochodne aktywacji dopełniacza - C3a i
C5a,

- Il8, RANTES, PAF i inne cytokiny

„

„

Agarozowa

Agarozowa

„

„

metoda

metoda

chemotaksji

chemotaksji

Schemat płytki
agarozowej z układem
wyciętych dołków
zawierających: I - czynnik
chemotaktyczny, II -
zawiesinę badanych
komórek, III - płyn
kontrolny.

B

A

I

II

III

I

II

III

Schemat pomiaru
chemotaksji ( A ) i
migracji spontanicznej
( B ).

Płytka z

chemotaks

ją. met.

agarozowa

STREFY CHEMOTAKSJI

STREFY CHEMOTAKSJI

- METODA

- METODA

AGAROZOWA

AGAROZOWA

POMIAR

POMIAR

CHEMOTAKS

CHEMOTAKS

JI

JI

Zawiesina
komórek

Roztwór czynnika
chemotaktyczneg
o

Filtr
miliporowy

Schemat komory do badania

chemotaksji wg Boydena

Komórki po

przejściu przez

filtr ( do

liczenia)

Kierunek
chemotaksji

KOMORA

KOMORA

BOYDENA

BOYDENA

Filtr po chemotaksji - met.

Filtr po chemotaksji - met.

Boydena

Boydena

Filtr po chemotaksji

Filtr po chemotaksji

(kontrola) - met. Boydena

(kontrola) - met. Boydena

ETAPY FAGOCYTOZY

ETAPY FAGOCYTOZY

Animation of Phagocytosis by Enhanced Attachment (Opsonization

Opsonizacja i fagocytoza

pseudopodia –

wypustki

błony

cytoplazmatyc

znej którymi

makrofag

wchłania

czerwoną

krwinkę

Wewnątrzkom

Wewnątrzkom

ó

ó

rkowe

rkowe

zabijanie i trawienie

zabijanie i trawienie

-

-

killing

killing



Niezależny od tlenu



ziarnistości lizosomalne



lizozym,



defensyny,



laktoferynę,



białka kationowe



enzymy:



kwaśna fosfataza,



peroksydaza,



zmiana Ph na kwaśne



Zależny od tlenu - Związany z

wytwarzaniem rodników tlenowych –

O

2-

, OH

.

, H

2

O

2

i NO.



oksydaza NADPH

Test NBT

W przebiegu pobudzenia fagocytów
procesami chemotaksji i fagocytozy ulega
aktywacji mechanizm wybuchu tlenowego,
(wybuch oddechowy) związany z

oksydazą

NADPH

W fagocytach wzrasta poziom nukleotydów

NADH i NADPH

.

Nukleotydy te wykazują zdolność redukcji
pochłoniętego przez komórki roztworu

błękitu nitrotetrazoliowego ( NBT) do
formazanu

.

Formazany

, związki nierozpuszczalne w

wodzie, odkładają się w cytoplazmie komórek
w postaci

ciemnoniebieskich złogów

.

Test NBT

PMNs od pacjenta zdrowego.

PMNs od pacjenta z

CGD

Defekty funkcjonalne

leukocytów

Defekty adherencji :



Defekt cząsteczek adhezyjnych LFA-1 i Mac-1

upośledza adhezję (LAD-1)



Brak sialyl-Lewis X, i defekty selektyny E- i P-

(LAD-2)

Defekty of chemotaksji/fagocytozy:



Defekt gromadzenia się mikrotubuli upośledza

poruszanie się i degranulację lizosomów. (Syndrom

Chediak-Higashi )



Fizjologicznie obniżona aktywność chemotaktyczna

neutrofilów występuje u noworodków i niemowląt

Defekt killingu



Nieaktywna oksydaza NADPH ( przewlekła choroba

ziarniniakowa)

Defe

Defe

kty funkcjonalne

kty funkcjonalne

leukocyt

leukocyt

ó

ó

w

w

Leukocyte Adhesion
Deficiencies
-zaburzenia interakcji
leukocyta z endotelium
naczyniowym

Defekt gromadzenia się
mikrotubuli upośledza
poruszanie się i degranulację
lizosomów. Defekty killingu i
chemotaksji

Zaburzenia killingu
zwiazane z defektem
oksydazy NADPH

Ocena komórkowych komponentów układu

immunologicznego człowieka

Limf.B

Limf.T

Fagocyty

Prawidło
wa liczba

(x10

9

/

litr
krwi)

Ocena
funkcji
in vivo

Ocena
funkcji
in vitro

Ocena humoralnych komponentów układu

immunologicznego człowieka

Immunoglobuliny

Dopełniac
z

Składni
k

Normalny
poziom u
dorosłych