Przeciwciała poliklonalne

i monoklonalne

1.

Różnice pomiędzy przeciwciałami

poliklonalnymi
i monoklonalnymi

2.

Produkcja przeciwciał poliklonalnych

•

przygotowanie antygenu

•

wybór zwierząt do immunizacji

•

podawanie antygenu zwierzętom immunizowanym

•

kontrola przebiegu reakcji immunologicznej

•

ocena uzyskanych przeciwciał; ich miano i swoistość

3.

Produkcja przeciwciał monoklonalnych

4.

Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych

Przeciwciała poliklonalne

Mieszanina cząsteczek przeciwciał

wytworzonych przez kilka klonów komórek.

Wiążą one różne części antygenu z różnym

powinowactwem.

Przeciwciała monoklonalne

Są wytwarzane przez pojedynczy klon komórek,

tzn. komórki siostrzane.

Wszystkie cząsteczki tych przeciwciał są

identyczne

i wiążą się z tym samym miejscem antygenu

z jednakowym powinowactwem.

TEORIA SELEKCJI KLONALNEJ

Otrzymywanie

surowicy poliklonalnej

Otrzymywanie

przeciwciał monoklonalnych

Pobierani

e

surowicy

Szczepienie myszy

antygenem

zawierającym 3 różne

determinanty

antygenowe

Mieszaninę przeciwciał

skierowanych przeciwko

trzem różnych

determinantom

antygenowym

Pobieranie

limfocytów

B

ze

śledziony

Komórki

szpiczaka

Powstają komórki

hybrydowe zdolne

do syntezy

przeciwciał

Przeciwciała

monoklonaln

e

IMMUNIZACJA

Przygotowanie

antgenu

HAPTENY

-

cząsteczki które nie są immunogenne,

chociaż mają właściwości antygenowe

Do haptenów należą:



hormony peptydowe,



hormony sterydowe,



niektóre leki (np. penicylina, aspiryna,
sulfonoamidy),



sacharydy wchodzące w skład antygenów
somatycznych
pałeczek Gram (-).

HAPTENY MOGĄ STAĆ SIĘ

IMMUNOGENNE PO ZWIĄZANIU Z

BIAŁKIEM - NOŚNIKIEM

HAPTENY

Doświadczenia Karla Landsteinera

Karl

Landsteiner

Nagroda Nobla

w 1930 r.

Po szczepieniu

Zdolność haptenów do indukowania swoistej odpowiedzi humoralnej po
związaniu z nośnikiem wykorzystuje się do otrzymywania przeciwciał
skierowanych np. przeciw

hormonom

. Przeciwciała te stosuje się w testach

diagnostycznych.

Związanie się haptenów z białkami organizmu np. białkami osocza może
prowadzić
do reakcji nadwrażliwości (uczuleń).

Przykłady sprzęgania haptenów

z nośnikiem białkowym

Rodzaj haptenu

Grupy

funkcyjne

Najczęstsze

rodzaje

pochodnych

Metoda

sprzęgania

z nośnikiem

Prostaglandy

ny

–COOH

(–OH, =O)

sprzęganie

bezpośrednie



karbodwuimidy



metoda

Erlangera

Sterydy

–OH

=O

bursztyniany

CMO-pochodne



metoda

Erlangera



karbodwuimidy

Nukleotydy

–OH rybozy

(–NH

2

)

bursztyniany



karbodwuimidy

Tyroniny

–COOH

–NH

2

bezpośrednie

sprzęgania

tyronin lub ich

estrów

metylowych



karbodwuimidy

Oligopeptydy

–COOH

–NH

2

(–OH)

Sprzęganie

bezpośrednie



karbodwuimidy



aldehyd

glutarowy

h

C

O

N

H

CH

2

b

-

H

2

O

h

C

O

NH

CH

2

b

OH

+

H

h

NH

2

+

O

C

H

CH

2

CH

2

CH

2

C

H

O

+

H

2

N

b

h

N

CH CH

2

CH

2

CH

2

CH

N

b

- 2H

2

O

Sprzęganie haptenu z nośnikiem

białkowym

Bezpośrednia reakcja haptenu lub jego pochodnej z nośnikiem

Sprzęganie haptenu z nośnikiem za pomocą związku pośredniego,

który tworzy „mostek„ między haptenem a nośnikiem

Reakcja sprzęgania haptenu lub jego

pochodnej (

h

) z białkiem (

b

)

Metoda „mieszanych bezwodników” (Erlangera)

O

C

O

C

HO

C

O

h

+

O

C

O

O

C

O

h

- HCl

+

H–N–H

b

CO

NH

h

b

+

O

C

O

OH

Hapten

o właściwościach

lipofilnych

Reakcja sprzęgania haptenu lub jego pochodnej (

h

) z

białkiem (

b

)

Kondensacja za pomocą karbodwuimidu (EDC)

C

N

N

N

O

C

H
O

h

+

N

H

H

b

N

C

N

N

O

C

O

h

+

CO

NH

h

b

+

N
H

C

N
H

N

O

Hapten

o właściwościach hydrofilnych

Niektóre stosowane adiuwanty

Adiuwant

Mechanizm działania

Olej parafinowy, arachidowy

(emulsje z wodnym roztworem

antygenu)

Tworzenie depot antygenu w miejscu podania:

opóźnianie uwalniania antygenu z tkanek,

wywoływanie zapalenia

w miejscu podania)

Wodorotlenek i fosforan glinu,

węglan i fosforan wapnia, cząsteczki

lateksu, akrylu, betonitu

Precypitacja rozpuszczalnych antygenów;

wywoływanie odczynu zapalnego, tworzenie depot

antygenu w tkankach

Zabite prątki gruźlicy i ich skłądniki

(MDP, PPD), Corynebacterium,

peptydyloglikan P40, Bordetella

pertussis

Aktywacja makrofagów, zwiększona synteza cytokin

(IL-1,

IL-4, IL-6, IFN, CSF) i skłądników dopełniacza;

poliklonalna aktywacja limfocytów T

Immunogenne białka (np. anatoksyna

tężcowa) połączone z antygenem

Aktywacja limfocytów T pomocniczych

ISCOM, SAF, pęcherzyki lipidowe

(liposomy)

Agregowanie antygenu na powierzchni, transport

antygenu do węzłów limfatycznych, ułatwianie

kontaktu z błoną komórki prezentującej antygen

LPS

Poliklonalna aktywacja limfocytów B

Nietoksyczne pochodne LPS

Aktywacja makrofagów, dopełniacza, indukcja

syntezy cytokin (GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, IL-1)

Mikrokapsułki

Transport antygenu do węzłów limfatycznych,

przedłużone uwalnianie antygenu

Inulina, zymozan

Ułatwianie alternatywnej drogi aktywacji kaskady

dopełniacza, ułątwianie interakcji antygenu z

komórkami posiadającymi receptor dla C3b

(makrofagi, limfocyty B, komórki dndrytyczne

ośrodków rozmnażania)

Cytokiny (interferony, IL-3, IL-12)

Aktywacja makrofagów, limfocytów T, stymulowanie

rozwoju subpopulacji Th)

0

1

2

3

4

5

6

7

Podawanie antygenu

Przeciwciała

monoklonalne

Produkcja przeciwciał monoklonalnych

Izolacja

mysich

limfocytów

Hodowla
komórek

szpiczaka

Fuzja
komórek

Hodowla hybryd

Klonowanie

pojedynczych

komórek hybryd

Brak

pożądanych

przeciwciał –

odrzucenie

komórek

Klonowanie

pojedynczych

komórek hybryd

Obecność

przeciwciał

przeciwko

antygenowi X

Hodowla

sklonowanyc

h komórek

Oczyszczanie

przeciwciał

monoklonalnych

Uczulenie

myszy

antygenem

X

Produkcja przeciwciał monoklonalnych

Postępowanie z hybrydami

Kryteria oceny jakości

przeciwciał



Wysokie miano



Duża swoistość (mała krzyżowa reaktywność z
analogami antygenu)



Maksymalna czułość (wysoka stała
powinowactwa)



Maksymalna stromość krzywej rozcieńczeń
surowicy odpornościowej



Najlepsza liniowość krzywej wzorcowej log-
logitowej (współczynnik regresji w zakresie 0,8-
1,2)



Mała wrażliwość na nieswoiste hamowanie
wiązania antygenu przez czynniki zawarte w
surowicy krwi
lub w wyciągach tkankowych

Reakcje krzyżowe

Przeciwciała mogą reagować nie tylko z antygenem, który in vivo wywołał

ich powstanie, lecz także z innymi antygenami o podobnej strukturze

(identyczny lub podobny fragment epitopu).

Przeciwciała anty-A

reagują krzyżowo z

antygenem B

.



Wykrywanie i określanie stężenia hormonów, enzymów i leków w
testach RIA
i ELISA



Oczyszczanie czynników i hormonów



Diagnostyka i lokalizacja nowotworów (ognisk pierwotnych i
przerzutów)



Leczenie nowotworów



Prognozowanie w chorobie nowotworowej



Immunosupresja (np. przeciwciał przeciw limfocytom T, IL-2 lub jej
receptorowi)

•

U pacjentów z przeszczepem allogenicznym

•

U pacjentów z chorobą autoimmunizacyjną



Wykrywanie antygenów HLA podczas doboru dawców przeszczepów



Wykrywanie antygenów mikroorganizmów w czssie diagnostyki
chorób zakaźnych



Zmniejszenie infekcyjności mikroorganizmów



Neutralizacja toksyn



Regulacja odpowiedzi immunologicznej (np. przeciwciała
antyidiotypowe)

Zastosowanie przeciwciał

monoklonalnych

Pochodne przeciwciał

monoklonalnych

Immunotoksyny

Przeciwciało

o podwójnej swoistości

Przeciwciało chimeryczne

Jednołańcuchowe białko wiążące antygen

(jednołańcuchowy fragment Fv)

Biwalentny fragment Fv

Fragment

Fv o podwójnej swoistości

Fv

CDR3

antygen

epitopy

Przeciwciała antygenizowane

The utilization of radiolabelled specialized proteins delivers radiation therapy directly to
a tumor site. This new form of gene therapy utilizes

"Smart Bomb"

technology and is

available at only a few sites in the US.

Przeciwciało

monoklonalne

przeciwko CD20

Przeciawciało znakowane izotopem

Wytwarzanie PM

„

uczłowieczonych

”

C V

KONIEC

Sprzęganie haptenów z białkiem

za pomocą karbodwuimidów

Hapten

Rozpuszczalnik

Karbodwuimi

d (CDI)

CDI : hapten

(stos.

molarny)

Czteropeptyd

gastryny

N, N-

dwumetyloformamid

morfo-CDC

3 : 1

ACTH

HCl

EDC

20 : 1

Angiotensyna

Woda destylowana

EDC

100 : 1

Trójjodotyroni

na

NaOH

EDC

25 : 1

Półbursztynia

n cAMP

Woda destylowana

EDC

3 : 1

Prostaglandyn

y

10% etanol w Na

2

CO

3

EDC

2 : 1

Półbursztynia

n 11

α

-

hydroksy-

progesteronu

Bezwodny dioksan

DCDI

3 : 1

Genetically engineered anti-TNF molecules

Reakcje homo- i heterologiczne

względem oznaczanej substancji

Typ układu

Nazwa reakcji

Przykłady

Przeciwciała

Hormon

znakowan

y

Hormon wzorcowy

i oznaczany

a-(fragm.)A

/A*/A

Superhomologicz

na

a–βHLH

HLH*

HLH

a–A /A*/A

Pełna

homologiczna

a-HGH

HGH*

HGH

a-B /A*/A

Niepełna

homologiczna

a–(E

2

–6

–

–

CMO– BSA)

a–BLH

E

2

*

PLH*

E

2

(estradiol)

PLH

a–A /B*/A

Niepełna

heterologiczna

a–BPRL

OPRL*

BPRL

(prolaktyna)

a–B /B*/A

Pełna

heterologiczna

a–PINS

PINS*

HINS (insulina)

a

–C /B*/A

Podwójnie

heterologiczna

a

–OPRL

PPRL*

HPRL

(prolaktyna)

H – ludzki (human)
P – wieprzowy (porcine)
N – bydlęcy (bovine)
O – owczy (ovine)

Tumor necrosis therapy utilizes monoclonal antibodies targeting
intracellular tumor antigens on necrotic (dead) tissue. This method
overcomes some of the limitations of current antibody-based
therapeutic approaches, reported Alan Epstein, MD, PhD, USC
Medical Center, department of pathology, LA, CA, at the 11th
International Conference on Monoclonal Antibodies for Cancer

Przeciwciała związane
z liposomami rozpoznają
komórkę nowotworową,
wnikają do niej i uwalniają
lek.

Przeciwciało rozpoznaje
białko

HER2/neu

,

występujące
na komórkach
nowotworowych w dużych
ilościach.



Reakcje krzyżowe wykorzystywane są w diagnostyce,
np. kiły.



Reakcje krzyżowe wykorzystywane są w szczepionkach.
Szczepienie wirusem krowianki (E. Jenner) lub wirusem
vaccinia chroni przed zachorowaniem na ospę, którą
wywołuje wirus variola.

Reakcje krzyżowe



Reakcje krzyżowe uczestniczą w reakcjach
autoimmunologicznych - jeśli zdarzy się, że antygeny
bakteryjne lub wirusowe mają podobne epitopy do
białek organizmu - zjawisko molekularnej mimikry.

•

Przeciwciała przeciwko białku M paciorkowców reagują krzyżowo

z białkami mięśnia sercowego

•

Przeciwciała przeciwko Campylobacter jejuni reagują krzyżowo
ze składnikami mieliny

•

Przeciwciała przeciw bakteryjnym białkom szoku termicznego
występują
u chorych z reaumatoidalnym zapaleniem stawów

Epitopes found on the mouse part of the construct in the

framework region (FR).

Anti-allotypic and anti-idiotypic

responses may also

contribute to drug immunogenicity.

<<< Click here to return