Kontrola jakości cytometru

przepływowego

Istotne jest przeprowadzanie standaryzacji aparatu poprzez :

-Codzienną, wewnętrzną kontrolę jakości układu optycznego,

elektronicznego oraz parametrów fluorescencji w celu zapewnienia
optymalnego działania aparatu.

-Udział w zewnętrznej, międzylaboratoryjnej kontroli jakości która

pozwala na ocenę i porównanie stosowanych procedur oraz na
ocenę jakości i wiarygodności badań.

-Ocenę pracy cytometru oraz używanych odczynników przy użyciu

polistyrenowych, o wystandaryzowanej średnicy fluorosfer lub
stabilizowanych preparatów komórek krwi ludzkiej.

-Standaryzację aparatu należy przeprowadzać z wykorzystaniem

identycznych parametrów odczytów zarówno dla prób kontrolnych
jak i materiału diagnozowanego.

OCENA STABILNOŚCI UKŁADÓW

OPTYCZNEGO ORAZ PRZEPŁYWOWEGO

Codzienną

kontrolę

układu

optycznego

i

przepływowego należy przeprowadzać przy użyciu
zestawu kontrolnego zawierającego zawiesinę
polistyrenowych kulek połączonych z fluorochromem
tzw. fluorosfer, zawieszonych w ośrodku wodnym w
odpowiednim stężeniu, zawierających surfaktanty i
konserwanty. Długość fali światła fluorescencyjnego
emitowanego przez barwnik zawarty w fluorosferach
powinien mieścić się w zakresie od 525 nm do 700
nm przy wzbudzeniu światłem lasera o długości fali
488 nm.
Do oceny uzyskiwanych parametrów należy
wykorzystać wcześniej utworzony wykres Levey-
Jenningsa, gdzie 95% wartości badanych
parametrów powinno mieścić się w zakresie ± 2SD.

OCENA STABILNOŚCI UKŁADÓW

OPTYCZNEGO ORAZ PRZEPŁYWOWEGO

Przygotować protokół zawierający cytogram FS vs SS

oraz

histogramy

jednoparametrowe

dla

FS

i

poszczególnych fluorescencji w skali logarytmicznej
określając wartość kolorów na 0%, na histogramach
należy założyć bramki liniowe.

Za pomocą detektorów ustawić pozycję pików

poszczególnych analizowanych fluorescencji na środku
każdego

histogramu.

Obramkowana

populacja

analizowanych fluorosfer na cytogramie FS vs SS
powinna zawierać min. 95% całości badanych kulek.

W ciągu 5 dni należy wykonać 20 kolejnych prób

kontrolnych, zebrać dane dotyczące wartości położenia
piku i HPCV, obliczyć wartości średnie SD i 2 SD i
utworzyć wykres Levey-Jenningsa.

Codzienną procedurę standaryzacji aparatu należy

wykonywać na podstawie protokołu do analizy zestawu
kontrolnego w sposób wyżej opisany, zapisywać wartości
HPCV oraz pozycję pików i nanosić na wykres Levey-
Jenningsa

Przykładowe histogramy fluorosfer

wyznakowanych fluorochromami FL1, FL2, FL3

i FL4 [1].

Przykład wykresu Levey-Jenningsa

OCENA STABILNOŚCI SYGNAŁÓW

FLUORESCENCJI ORAZ WERYFIKACJA

LINIOWOŚCI.

Ustalenie

standardów

intensywności

fluorescencji oraz weryfikację liniowości aparatu
stosuje się dla zapewnienia tego samego
wzmocnienia dla sygnałów o małej i dużej
intensywności.

W tym celu można użyć zestawu zawierającego

fluorosfery o różnych, lecz ściśle określonych
poziomach intensywnościach fluorescencji.

Długość światła emitowanego przez barwnik

zawarty w fluorosferach powinien mieścić się w
zakresie od 525 nm do 700 nm przy wzbudzeniu
światłem lasera o długości fali 488 nm.

OCENA STABILNOŚCI SYGNAŁÓW

FLUORESCENCJI ORAZ WERYFIKACJA

LINIOWOŚCI.

Należy utworzyć protokół zawierający
cytogram FS vs SS oraz histogramy
jednoparametrowe

dla

FS

i

poszczególnych

fluorescencji

w

skali

logarytmicznej,

następnie

analizować

próbkę składającą się ze wszystkich
połączonych fluorosfer. Określić każdą
wartość szczytową fluorescencji, zapisując
średnie wartości dla danego kanału.
Wykres

średnich

wartości

powinien

tworzyć linię prostą, co świadczy o
prawidłowym skalibrowaniu aparatu [26,
28, 29].

OCENA KOMPENSACJI FLUORESCENCJI

ORAZ CZUŁOŚCI CYTOMETRU

.

Należy

dokładnie

wyregulować

ustawienia

kompensacji kolorów oraz czułość aparatu. W tym
celu można wykorzystać gotowe zestawy
kontrolne oferowane przez różne firmy.
Mogą to być zestawy kulek fluorescencyjnych
jedno-, dwu- lub trzy kolorowych. Każdy z tych
zestawów zawiera oprócz barwionych fluorosfer
(FITC, PE, PerCP lub PerCP-Cy5,5 oraz APC)
również kulki niewybarwione. Niewybarwione
kulki pozwalają na dokładne określenie pozycji
oraz zakresu kanałów, w jakiej powinna znajdować
się tzw. „negatywna kontrola”. Różnica pomiędzy
średnią wartością kanału dla niewybarwionych
kulek oraz średnią wartością kanału, w którym
znajdują się fluorosfery połączone z odpowiednim
barwnikiem pozwalają określić czułość aparatu.

Kompensacjafluorescencji

Zła

FL1

F

L

2

Dobra

x-mean
Q1=Q3

y-mean
Q3=Q4

1 2
3 4

FL1

F

L

2

Za mała

FL2-%FL1

y-mean
Q3 < Q4

1 2
3 4

FL1

L

F

L

2

Za duża

FL2-%FL1

i

Za duża

FL1-%FL2

y-mean
Q3 > Q4

x-mean
Q1 < Q3

1 2
3 4

Histogramy dwuparametrowe komórek kontrolnych

wyznakowanych przeciwciałami w kombinacjach z

użyciem 4 kolorów FITC, RD1, ECD, PC5, dla populacji

limfocytów (bramka A), cytometr COULTER EPICS XL [8].