Badanie obecności
endotoksyn
bakteryjnych
Test LAL
Badanie obecności
endotoksyn
bakteryjnych
Test LAL
Test LAL
Test LAL jest polecany przez FP (FPVII
t.I; 2.6.14)
Przeznaczony jest do
wykrywania in
vitro obecności lub określania
zawartości
endotoksyn
w
preparatach leczniczych do
stosowania pozajelitowego oraz
niektórych materiałach medycznych
Zasada testu LAL
Test opiera się na zastosowaniu
lizatu amebocytów skrzypłocza
Limulus polyphemus
lub
Tachypleus tridentatus
do
wykrywania lub oznaczania
zawartości endotoksyn bakterii
Gram-ujemnych
Historia powstania
testu
W 1956 roku Bang opublikował
informację, że infekcja Limulus
polyphemus bakteriami Gram-
ujemnymi prowadzi do zakrzepu
wewnątrznaczyniowego
Wykazano, że zakrzep jest
wynikiem reakcji pomiędzy
endotoksyną i białkiem
skrzepującym w krążących
amebocytach kraba
Dokładniej:
endotoksyna
aktywuje proenzym do
koagulazy, która
przeprowadza koagulogen
w koagulinę
Skrzypłocze
(mieczogony)
Stawonogi z rzędu ostrogonów
Żywe skamieliny – żyją od ok.
350 mln lat
Występują w Oceanie
Atlantyckim u wybrzeży Ameryki
Północnej i Środkowej oraz przy
azjatyckich brzegach Pacyfiku
Długość 60 - 90 cm, kształt
podkowiastej tarczy
W wodzie poruszają się
zwrócone częścią grzbietową w
dół
Samice składają do piasku na
brzegu oceanu jaja, które
natychmiast są zapładniane
przez samce.
Osiągają dojrzałość płciową w
wieku ok. 10 lat
Występowanie różnych
gatunków skrzypłoczy
Obszar
serca
Osierdzie
Oczy
Przygotowywanie lizatu
amebocytów skrzypłocza
Przygotowywanie lizatu
amebocytów skrzypłocza
Przygotowywanie lizatu
amebocytów skrzypłocza
„Arystokratyczną” krew skrzypłocze zawdzięczają
hemocyjaninie
Błękitna
krew
Przygotowywanie lizatu
amebocytów skrzypłocza
Przygotowywanie lizatu
amebocytów skrzypłocza
Każdego kraba
Każdego kraba
nakłuwa się
nakłuwa się
nową igłą i
nową igłą i
krew zbiera do
krew zbiera do
pojemnika
pojemnika
Przygotowywanie lizatu
amebocytów skrzypłocza
Amebocyt
Przygotowywanie lizatu
amebocytów skrzypłocza
Kraby po skrwawianiu
Kraby po skrwawianiu
Przygotowywanie lizatu
amebocytów skrzypłocza
Powrót do domu
Powrót do domu
Metody badania
endotoksyn bakteryjnych
Metoda żelowa
Badanie graniczne
Badanie półilościowe
Metoda zmętnieniowa
(turbidymetryczna)
Metoda chromogenna
W razie wątpliwości wynik badania
granicznego metodą żelową ma znaczenie
rozstrzygające
Metody badania
endotoksyn bakteryjnych
Metoda zmętnieniowa (turbidymetryczna
)
Polega na fotometrycznym pomiarze wzrostu
zmętnienia w wyniku rozszczepienia
endogennego substratu (wynik reakcji
endotoksyn z lizatem)
Metoda chromogenna
Polega na fotometrycznym pomiarze ilości
chromoforu uwolnionego z odpowiedniego
chromogennego peptydu w wyniku reakcji
endotoksyn z lizatem
Metody badania
endotoksyn bakteryjnych
Metoda zmętnieniowa i chromogenna
mogą być wykonywane w 2 wariantach:
pomiar punktu końcowego
-
największego rozcieńczenia preparatu
dającego wynik dodatni
pomiar kinetyczny
– pomiar czasu
potrzebnego do uzyskania określonego
zmętnienia lub zabarwienia
Odczynniki
Aparatura i szkło- nowe końcówki do pipet
lub szkło autoklawowane co najmniej 30 min
w temp. 250
ºC
Lizat amebocytów o określonej czułości λ
Najczęściej dostępne są lizaty o następującej czułości:
0,250 EU/ml; 0,125 EU/ml; 0,06 EU/ml i 0,03 EU/ml
Czułość lizatu określa granicę detekcji testu.
Jest to najmniejsze stężenie endotoksyn, jakie
można wykryć za pomocą użytego lizatu
Odczynniki
Standardowa Endotoksyna Kontrolna
(CSE), której moc określono na podstawie
Referencyjnej Endotoksyny Standardowej (RSE)
FDA oraz partii lizatu stanowiącego element
zestawu
Endotoksynę oczyszcza się zazwyczaj z
E.coli
Woda LRW (LAL Reagent Water)
Nie wywołuje żelowania rozpuszczonego lizatu po 24 h
inkubacji w 37°C
Test żelowy - zasada
Technika żelowa umożliwia wykrycie lub
oznaczenie zawartości endotoksyn i
polega
na krzepnięciu lizatu w obecności endotoksyn
Wykonanie oznaczenia zawartości
endotoksyn polega na
:
sporządzeniu serii 2-krotnych rozcieńczeń
badanego preparatu,
określeniu punktu końcowego – największego
rozcieńczenia preparatu dającego wynik
dodatni
.
Test żelowy – etapy
badania
1.
Przygotowanie roztworu podstawowego
oraz odpowiednich rozcieńczeń
endotoksyny wzorcowej
2.
Przygotowanie roztworów badanych –
rozpuszczenie i/lub rozcieńczenie wodą LAL
pH badanej próby powinno zawierać się w
zakresie od 6,0 – 8,0
Test żelowy – etapy badania
- cd.
3.
Określanie granicznej zawartości endotoksyn
Określona w monografii FP
Obliczona na podstawie największej dawki
leczniczej, zgodnie ze wzorem K/M
K = progowa dawka endotoksyny/kg masy ciała/1 h
K = 5,0 EU/kg m.c./1 h przy podaniu pozajelitowym oraz
0,2 EU/kg m.c./1 h przy podaniu dooponowym
M = najwyższa zalecana dawka leku/kg masy ciała/1 h
Test żelowy – etapy
badania- cd.
4.
Określanie Największego Dopuszczalnego
Rozcieńczenia (NDR) - maksymalne rozcieńczenie
próbki, w którym możliwe jest oznaczenie
granicznej zawartości endotoksyn
graniczna zawartość endotoksyn
x C
NDR = ————————————————
λ
gdzie:
C – stężenie badanego roztworu
graniczna zawartość endotoksyn w substancji czynnej stosowanej
pozajelitowo zależy od jej dawkowania i jest wyrażona wzorem K / M;
K- progowa dawka gorączkotwórcza endotoksyny w przeliczeniu na kg masy
ciała zastosowana do 1 godz
M- najwyższa zalecana dawka lecznicza produktu w przeliczeniu na kg masy
ciała zastosowana w czasie do 1 godz
Test żelowy – etapy
badania-cd
5.
Badania walidacyjne
Potwierdzenie deklarowanej czułości lizatu
Wymagane gdy:
1.
zastosowano nową serię lizatu
2.
wprowadzono zmianę w warunkach oznaczeń
Bada się 4 stężenia endotoksyny
odpowiadające 2λ, λ, 0,5 λ i 0,25 λ. Czułość
lizatu powinna się mieścić w zakresie 0,5 – 2
λ
Test żelowy – etapy
badania-cd
5.
Badania walidacyjne – cd.
Badanie obecności czynników
interferujących w próbce:
1.
Do badania używa się roztwory badane
niezawierające wykrywalnych endotoksyn
w rozcieńczeniach niższych niż NDR,
2.
Dodaje się do nich endotoksynę w stężeniu
odpowiadającym 2λ, λ, 0,5 λ i 0,25 λ.
Oznaczenie musi potwierdzać deklarowaną
czułość lizatu
Test żelowy – etapy
badania-cd
5.
Badania walidacyjne – cd.
Postępowanie w razie stwierdzenia
czynników interferujących
zastosować większe rozcieńczenie, ale mniejsze
niż NDR
zastosować bardziej czuły lizat – zapewni to
możliwość większego rozcieńczania
ultrafiltracja, neutralizacja, dializa, inaktywacja
termiczna – metody te muszą być zwalidowane
m.in. należy sprawdzić czy postępowanie nie
usuwa endotoksyn
Test żelowy - wykonanie
Każde oznaczenie powinno zawierać w
dwóch powtórzeniach:
1.
Próbę badaną – preparat + lizat
2.
Kontrolę ujemną – woda LAL + lizat
3.
Kontrolę dodatnia – endotosyna 2λ +
lizat
4.
Kontrolę dodatnią produktu – preparat
+ endotosyna 2λ + lizat
Test żelowy – wykonanie –
cd.
100 μl badanego roztworu zmieszać ze
100 μl lizatu i inkubować 60min ± 2 min
w 37 ± 1°C
Po inkubacji wyjąć probówki z
inkubatora i obrócić ostrożnie o 180°
Powstanie spoistego żelu
przylegającego do dna probówki po jej
odwróceniu oznacza wynik dodatni
Test żelowy – wykonanie –
cd.
Obliczanie zawartości endotoksyn
Należy pomnożyć deklarowaną czułość
lizatu przez wartość największego
rozcieńczenia dającego wynik dodatni
Dziękuję z uwagę