Metody badań

strukturalnych

Spektrometria masowa

Spektrometria masowa (MS – Mass

Spectrometry) to dynamicznie rozwijająca
się metoda analizy instrumentalnej
związków organicznych. Badany związek
doprowadza się do jonizacji i rozpadu na
naładowane fragmenty, które przyspiesza
się polem elektrycznym. Uzyskany
strumień jonów rozdziela się wg stosunku
ich masy do ładunku i mierzy natężenie
prądu jonowego odpowiadające
poszczególnym jonom.

Zastosowanie spektrometrii masowej:

- określanie masy atomowej związku chemicznego,
- badania strukturalne izomerów,
- badania strukturalne biopolimerów i związków

pochodzenia naturalnego

Sprzężenie z chromatografią

Aparatura

Metody jonizacji próbki:

- jonizacja strumieniem elektronów (EI),
- jonizacja chemiczna (CI),
- jonizacja polem (FI),

- bombardowanie szybkimi atomami (FAB)

- ESI (Elecrtospray Ionization)

- MALDI (Matrix Assisted Laser

Desorption/Ionization)

MALDI

Próbka umieszczona w
matrycy jest zdyspergowana
na powierzchni, a następnie
ulega desorpcji i jonizacji
na skutek działania laserem.
Metoda ta jest stosowana
głównie do sekwencjonowania
peptydów i określania
masy cząsteczkowej białek.

ESI

Technika stosowana do
badania rozpuszczalnych
w wodzie biomolekuł:
peptydów, białek, cukrów.
Spektrometr masowy jest
najczęściej sprzężony z LC.
Próbka jest rozpylana i
jonizowana za pomocą
przyłożonego napięcia,
rzędu kilku kV.

Analizatory stosowane w spektrometrach

masowych:

• analizatory magnetyczne,
• analizatory kwadrupolowe,
• analizatory mierzące czas przelotu jonów,
• analizatory cyklotronowego rezonansu

jonowego.

Najistotniejsze cechy analizatora to:
• rozdzielczość,
• zakres mas cząsteczkowych w których można

wykonywać pomiar,

• czułość

Elektroforeza 2D

• Rozdział białek pod

względem

– Masy cząsteczkowej

(Mw)

– Punktu

izoelektrycznego (pI)

• Barwienie

• Analiza uzyskanej

mapy peptydowej

Elektroforeza 2D

Bécamel et al., Biol. Proced. Online 2002;4:94-104.

Spektrometr masowy

Jonizator

próba

+

_

Analizator masy

Detektor

•

MALDI

•

Electro-Spray
Ionization (ESI)

•

Time-Of-Flight (TOF)

•

Quadrapole

•

Ion-Trap

•

Electron
Multiplier
(EM)

Spektrometr masowy

(MALDI-TOF)

Detector

(linear mode)

Reflectron

N

2

Laser

Lens

Detector
(reflectron mode)

Target plate
with sample

Energy transfer
from matrix to
sample

Matryca

Próba

Laser

Jonizacja

Schemat procesu MALDI

(a)

Spektrometr masowy

(MALDI-TOF)

Source

Length = s

Field-free drift zone

Length = D

E

d

= 0

Microchan

nel plate

detector

Backing plate
(grounded)

Extraction grid
(source voltage -V

s

)

UV (337
nm)

Detector grid
-V

s

Pulse
voltag
e

Analyte
/matrix

Spektrum masowe

Masa cząsteczkowa jest podstawą

analizy

Identyfikacja białek techniką

Peptide Mass Fingerprint

Wycięcie

frakcji

z żelu 2D

Peptide Mass Fingerprint

Trawienie

trypsyną

Spektrometria masowa

• Zalety

– Precyzyjne oznaczenie masy cząsteczkowej
– Możliwość przeprowadzenia fragmentacji
– Technologia wysoko zautomatyzowana

• Słabości

– Najlepsze wyniki wtedy, gdy mamy tylko kilka

molekuł w tym samym czasie

– Najlepsze wyniki dla małych cząsteczek
– Możliwe wyznaczenie stosunku masy do

niesionego ładunku

– Intensywność sygnału ≠ ilości badanej substancji

LC/MS w celu wykazania ilości

peptydów

Trawienie enzymatyczne

i frakcjonowanie

LC/MS for Peptide Abundance

LC/MS: 1 spektrum masowe co 1-2 sekundy

Spektrometria

masowa

Chromatografia cieczowa

De Novo Interpretation

Amino-
Acid

Residual

MW

Amino-
Acid

Residual

MW

A Alanine

71.03712 M Methionine 131.04049

C Cysteine

103.00919 N Asparagin

e

114.04293

D Aspartic

acid

115.02695 P Proline

97.05277

E Glutamic

acid

129.04260 Q Glutamine

128.05858

F Phenylalani

ne

147.06842 R Arginine

156.10112

G Glycine

57.02147 S Serine

87.03203

H Histidine

137.05891 T Threonine

101.04768

I

Isoleucine

113.08407 V Valine

99.06842

K Lysine

128.09497 W Tryptophan

186.07932

L Leucine

113.08407 Y Tyrosine

163.06333

Mascot MS/MS Ions Search