Podstawy teoretyczne

Podstawy teoretyczne

chromatografii

chromatografii

cieczowej, aparatura

cieczowej, aparatura

(pompa, kolumny,

(pompa, kolumny,

detektory)

detektory)



Chromatografia (gr. chromatos =

Chromatografia (gr. chromatos =

barwa + grapho = pisze) to technika

barwa + grapho = pisze) to technika

analityczna lub preparatywna służąca

analityczna lub preparatywna służąca

do rozdzielania lub badania składu

do rozdzielania lub badania składu

mieszanin związków chemicznych.

mieszanin związków chemicznych.



Termin chromatografia oznacza efekt

Termin chromatografia oznacza efekt

rozdziału (separacji) mieszaniny substancji

rozdziału (separacji) mieszaniny substancji

na jej składniki, obserwowany podczas

na jej składniki, obserwowany podczas

przepływu fazy ruchomej wzdłuż

przepływu fazy ruchomej wzdłuż

powierzchni fazy nieruchomej. Cząsteczki

powierzchni fazy nieruchomej. Cząsteczki

składników mieszaniny, które słabo

składników mieszaniny, które słabo

oddziałują z fazą nieruchomą, są szybciej

oddziałują z fazą nieruchomą, są szybciej

unoszone przez płynącą fazę ruchomą, zaś

unoszone przez płynącą fazę ruchomą, zaś

cząsteczki przyciągane mocniej poruszają

cząsteczki przyciągane mocniej poruszają

się wolniej. Fazą ruchomą może być gaz

się wolniej. Fazą ruchomą może być gaz

ciecz lub ciecz w stanie nadkrytycznym, zaś

ciecz lub ciecz w stanie nadkrytycznym, zaś

fazą nieruchomą (stacjonarną) - ciecz, żel

fazą nieruchomą (stacjonarną) - ciecz, żel

lub porowate ciało stałe.

lub porowate ciało stałe.



Pierwszego chromatograficznego

Pierwszego chromatograficznego

rozdziału mieszaniny barwników

rozdziału mieszaniny barwników

organicznych dokonał w

organicznych dokonał w

Warszawie profesor Michaił Cwiet.

Warszawie profesor Michaił Cwiet.

W oryginalnym opisie

W oryginalnym opisie

doświadczenia datowanym na 23

doświadczenia datowanym na 23

kwietnia 1905 r. znajdujemy

kwietnia 1905 r. znajdujemy

informację, że użyto kolumny

informację, że użyto kolumny

szklanej wypełnionej

szklanej wypełnionej

sproszkowanym węglanem

sproszkowanym węglanem

wapnia (kredy). Chloroformowy

wapnia (kredy). Chloroformowy

roztwór barwników organicznych,

roztwór barwników organicznych,

nanoszony na wierzchołek

nanoszony na wierzchołek

kolumny, w miarę przechodzenia

kolumny, w miarę przechodzenia

przez warstwę kredy ulegał

przez warstwę kredy ulegał

rozdziałowi i poszczególne

rozdziałowi i poszczególne

składniki były widoczne w postaci

składniki były widoczne w postaci

barwnych stref. Po wyjęciu słupka

barwnych stref. Po wyjęciu słupka

kredy z kolumny można było go

kredy z kolumny można było go

podzielić i wyodrębnić

podzielić i wyodrębnić

poszczególne składniki.

poszczególne składniki.

Klasyfikacja

Klasyfikacja



Stan skupienia fazy ruchomej-

Stan skupienia fazy ruchomej-

gazowa, cieczowa, fluidalna

gazowa, cieczowa, fluidalna



Stan skupienia fazy stacjonarnej-

Stan skupienia fazy stacjonarnej-

ciecz na nośniku lub ciało stałe

ciecz na nośniku lub ciało stałe

(adsorbent, wymieniacz jonowy lub

(adsorbent, wymieniacz jonowy lub

sito molekularne

sito molekularne

Mechanizm

Mechanizm



różnica w zdolności adsorpcyjnej

różnica w zdolności adsorpcyjnej

fazy stacjonarnej względem

fazy stacjonarnej względem

różnych składników znajdujących

różnych składników znajdujących

się w fazie ruchomej

się w fazie ruchomej

(chromatografia adsorpcyjna);

(chromatografia adsorpcyjna);



różnica wielkości współczynnika

różnica wielkości współczynnika

podziału składników

podziału składników

rozdzielanych między cieczą

rozdzielanych między cieczą

umieszczoną na nośniku (w fazie

umieszczoną na nośniku (w fazie

stacjonarnej) a fazą ruchomą

stacjonarnej) a fazą ruchomą

(chromatografia podziałowa);

(chromatografia podziałowa);



różnica wielkości cząsteczek

różnica wielkości cząsteczek

separowanych składników

separowanych składników

(chromatografia sitowa);

(chromatografia sitowa);



zatrzymywanie jonów na podłożu

zatrzymywanie jonów na podłożu

jonitowym (chromatografia

jonitowym (chromatografia

jonowymienna).

jonowymienna).

Chromatografia cieczowa

Chromatografia cieczowa



Możliwość analizy większej ilości

Możliwość analizy większej ilości

związków niż za pomocą chromatografii

związków niż za pomocą chromatografii

gazowej-ok.80%znanych związków

gazowej-ok.80%znanych związków

chemicznych

chemicznych



Warunkiem możliwości analizowania

Warunkiem możliwości analizowania

jest rozpuszczalność związków

jest rozpuszczalność związków



Mogą to być ciecze i ciała stałe, w tym

Mogą to być ciecze i ciała stałe, w tym

związki ulegające łatwo rozkładowi

związki ulegające łatwo rozkładowi

termicznemu, polimery i związki

termicznemu, polimery i związki

nieorganiczne

nieorganiczne



Chromatografię cieczową dzieli się na

Chromatografię cieczową dzieli się na

kolumnową i planarną

kolumnową i planarną



Ch.kolumnowa tradycyjna jest

Ch.kolumnowa tradycyjna jest

obecnie stosowana rzadko. Kolumna

obecnie stosowana rzadko. Kolumna

ma długość 10-100cm i średnicę 1-

ma długość 10-100cm i średnicę 1-

5cm. Czas analizy może wynosić do

5cm. Czas analizy może wynosić do

kilkunastu godzin. Faza ruchoma

kilkunastu godzin. Faza ruchoma

przepływa przez kolumnę pod

przepływa przez kolumnę pod

działaniem siły ciężkości. Do wad

działaniem siły ciężkości. Do wad

należy również mała rozdzielczość i

należy również mała rozdzielczość i

duże zużycie fazy ruchomej.

duże zużycie fazy ruchomej.



Chromatografia kolumnowa zwykła

Chromatografia kolumnowa zwykła

nie ma obecnie praktycznego

nie ma obecnie praktycznego

znaczenia wanalizie chemicznej i jest

znaczenia wanalizie chemicznej i jest

stosowana zwłaszcza do oczyszczania

stosowana zwłaszcza do oczyszczania

i rozdzielania składników mieszanin

i rozdzielania składników mieszanin

na skalę preparatywną

na skalę preparatywną



Do analizy stosuje się znacznie

Do analizy stosuje się znacznie

bardziej udoskonalony wariant-

bardziej udoskonalony wariant-

wysokosprawną chromatografię

wysokosprawną chromatografię

cieczową

cieczową

Wysokosprawna chromatografia

Wysokosprawna chromatografia

cieczowa (HPLC - high

cieczowa (HPLC - high

performance liquid

performance liquid

chromatography)

chromatography)



Uniwersalna metodą analityczna, stosowana

Uniwersalna metodą analityczna, stosowana

głównie do analiz złożonych próbek,

głównie do analiz złożonych próbek,

zwłaszcza zawierających nielotne,

zwłaszcza zawierających nielotne,

wielkocząsteczkowe związki chemiczne, w

wielkocząsteczkowe związki chemiczne, w

szczególności substancje biologicznie czynne.

szczególności substancje biologicznie czynne.

Skład fazy ciekłej i rodzaj fazy stacjonarnej

Skład fazy ciekłej i rodzaj fazy stacjonarnej

jest uzależniony od składu badanych próbek

jest uzależniony od składu badanych próbek

oraz typu oddziaływań wykorzystywanych do

oraz typu oddziaływań wykorzystywanych do

osiągnięcia separacji ich składników.

osiągnięcia separacji ich składników.

Aparatura

Aparatura



Analizę wykonuje się za pomocą

Analizę wykonuje się za pomocą

chromatografów cieczowych

chromatografów cieczowych



Fazę ruchomą pompuje się (po filtracji i

Fazę ruchomą pompuje się (po filtracji i

odgazowaniu) przez kolumnę

odgazowaniu) przez kolumnę



Analizowaną próbkę nastrzykuje się na

Analizowaną próbkę nastrzykuje się na

szczyt kolumny

szczyt kolumny



Składniki rozdzielone po wyjściu z kolumny

Składniki rozdzielone po wyjściu z kolumny

są wykrywane przez detektor

są wykrywane przez detektor



Sygnał z detektora jest zapisywany przez

Sygnał z detektora jest zapisywany przez

rejestrator

rejestrator

Podstawowe części

Podstawowe części

chromatografu to:

chromatografu to:



zbiornik fazy ruchomej

zbiornik fazy ruchomej



filtr

filtr



pompa

pompa



manometr

manometr



dozownik

dozownik



kolumna

kolumna



termostat

termostat



detektor

detektor



wzmacniacz

wzmacniacz



rejestrator, komputer

rejestrator, komputer



automatyczny dozownik

automatyczny dozownik

Pompy

Pompy



Powodują przepływ fazy ruchomej w

Powodują przepływ fazy ruchomej w

sposób ciągły, odtwarzalny i z optymalną

sposób ciągły, odtwarzalny i z optymalną

prędkością

prędkością



Dobre pompy powinny się

Dobre pompy powinny się

charakteryzować stałym przepływem fazy

charakteryzować stałym przepływem fazy

ruchomej z możliwością regulacji,

ruchomej z możliwością regulacji,

odpornością chemiczną materiału pompy,

odpornością chemiczną materiału pompy,

małą objętością wewnętrzną,

małą objętością wewnętrzną,

bezpulsacyjnym przepływem, możliwością

bezpulsacyjnym przepływem, możliwością

uzyskania ciśnień roboczych do 35MPa

uzyskania ciśnień roboczych do 35MPa

Istnieją dwie kategorie układów

Istnieją dwie kategorie układów

pompujących:

pompujących:



stałociśnieniowe

stałociśnieniowe



stałoprzepływowe

stałoprzepływowe

Pompy stałociśnieniowe

Pompy stałociśnieniowe



Są rzadko stosowane. Są to pompy

Są rzadko stosowane. Są to pompy

wyporowe oraz z tłokami o różnej

wyporowe oraz z tłokami o różnej

średnicy z napędem pneumatycznym

średnicy z napędem pneumatycznym



Mają prostą konstrukcję, brak pulsacji

Mają prostą konstrukcję, brak pulsacji

ciśnień

ciśnień



Wadą jest możliwość zmian

Wadą jest możliwość zmian

przepływu fazy ruchomej

przepływu fazy ruchomej

Pompy stałoprzepływowe

Pompy stałoprzepływowe



Istnieje kilka typów:

Istnieje kilka typów:

strzykawkowe-pracują

strzykawkowe-pracują

bezpulsacyjnie, mała ilość fazy

bezpulsacyjnie, mała ilość fazy

ruchomej zużywana w jednym

ruchomej zużywana w jednym

cyklu pracy oraz tłokowe-

cyklu pracy oraz tłokowe-

najpowszechniej stosowane

najpowszechniej stosowane



Powszechnie stosowane

Powszechnie stosowane

Pompy tłokowe

Pompy tłokowe



Jeden lub dwa tłoki

Jeden lub dwa tłoki



Tłoki przesuwają się w cylindrach o

Tłoki przesuwają się w cylindrach o

małej objętości (0,03-1ml)

małej objętości (0,03-1ml)



Można uzyskać przepływ w granicach

Można uzyskać przepływ w granicach

0,1-30ml/min, wytwarzane ciśnienia

0,1-30ml/min, wytwarzane ciśnienia

do 50MPa

do 50MPa



Wadą może być pulsacja cieczy

Wadą może być pulsacja cieczy

Kolumny

Kolumny



W zależności od wielkości próby

W zależności od wielkości próby

istnieją mikrokolumny, kolumny

istnieją mikrokolumny, kolumny

analityczne i preparatywne

analityczne i preparatywne



Do celów analitycznych zwykle

Do celów analitycznych zwykle

stosowane są kolumny analityczne

stosowane są kolumny analityczne



Najczęściej są to rurki ze stali

Najczęściej są to rurki ze stali

nierdzewnej o wypolerowanej

nierdzewnej o wypolerowanej

powierzchni wewnętrznej

powierzchni wewnętrznej

Kolumny

Kolumny



Długość od 5 do 35cm

Długość od 5 do 35cm



Średnica wewnętrzna 4,6mm

Średnica wewnętrzna 4,6mm



Długość zależy od średnicy ziaren

Długość zależy od średnicy ziaren

wypełnienia. Im ziarno mniejsze tym

wypełnienia. Im ziarno mniejsze tym

kolumna krótsza.

kolumna krótsza.



Zamknięte z dwóch stron filtrami i

Zamknięte z dwóch stron filtrami i

łącznikami do połączenia z

łącznikami do połączenia z

dozownikiem i detektorem

dozownikiem i detektorem

Wypełnienia kolumn

Wypełnienia kolumn



wypełnienia krzemionkowe-używane

wypełnienia krzemionkowe-używane

w większości analiz

w większości analiz



wypełnienia wykorzystujące żywice

wypełnienia wykorzystujące żywice

porowate

porowate

Wypełnienia kolumn

Wypełnienia kolumn



o dużych ziarnach z głębokimi szerokimi

o dużych ziarnach z głębokimi szerokimi

porami

porami



powierzchniowo porowate, z cienką

powierzchniowo porowate, z cienką

warstwą adsorpcyjną na nieprzenikliwym

warstwą adsorpcyjną na nieprzenikliwym

rdzeniu

rdzeniu



o bardzo małej średnicy ziaren i

o bardzo małej średnicy ziaren i

mikroporach w całej masie ziarna

mikroporach w całej masie ziarna

wykorzystywane jako adsorbenty, matryca

wykorzystywane jako adsorbenty, matryca

dla faz chemicznie związanych,

dla faz chemicznie związanych,

wypełnienia dla chromatografii sitowej

wypełnienia dla chromatografii sitowej

Fazy chemiczne związane na

Fazy chemiczne związane na

bazie krzemionki

bazie krzemionki



z niepolarnymi grupami-

z niepolarnymi grupami-

chromatografia w odwróconym

chromatografia w odwróconym

układzie faz

układzie faz



z polarnymi grupami-chromatografia

z polarnymi grupami-chromatografia

w normalnym układzie faz

w normalnym układzie faz



z grupami jonowymiennymi

z grupami jonowymiennymi



z grupami optycznie czynnymi

z grupami optycznie czynnymi



Napełnianie kolumn wymaga

Napełnianie kolumn wymaga

profesjonalnego oprzyrządowania i

profesjonalnego oprzyrządowania i

dobrego przygotowania

dobrego przygotowania



Często stosowane są kolumny z

Często stosowane są kolumny z

wypełnieniem

wypełnieniem



Można je napełniać techniką suchą i

Można je napełniać techniką suchą i

mokrą (sporządzenie zawiesiny

mokrą (sporządzenie zawiesiny

wypełnienia w rozpuszczalniku o

wypełnienia w rozpuszczalniku o

gęstości zbliżonej do wypełnienia)

gęstości zbliżonej do wypełnienia)

Detektory

Detektory

Dobry detektor powinien

Dobry detektor powinien

charakteryzować się: dużą

charakteryzować się: dużą

czułością, szerokim zakresem

czułością, szerokim zakresem

liniowości wskazań, małą

liniowości wskazań, małą

objętością, niewrażliwośią na

objętością, niewrażliwośią na

zmiany temperatury i prędkości

zmiany temperatury i prędkości

przepływu fazy ruchomej,

przepływu fazy ruchomej,

łatwością obsługi

łatwością obsługi

Detektory do HPLC dzielimy na

Detektory do HPLC dzielimy na

dwa rodzaje:

dwa rodzaje:



pomiar właściwości

pomiar właściwości

charakterystycznej dla próbki

charakterystycznej dla próbki



różnicowy pomiar właściwości

różnicowy pomiar właściwości

charakterystycznej dla próbki i fazy

charakterystycznej dla próbki i fazy

ruchomej

ruchomej

Detektory

Detektory

spektrofotometryczne UV

spektrofotometryczne UV

działają na zasadzie absorpcji

działają na zasadzie absorpcji

promieniowania UV

promieniowania UV



pracujące przy jednej długości fali

pracujące przy jednej długości fali

(254nm)

(254nm)



pracujące w bliskim nadfiolecie i

pracujące w bliskim nadfiolecie i

zakresie widzialnym z płynnym

zakresie widzialnym z płynnym

nastawianiem mierzonej długości fali

nastawianiem mierzonej długości fali



detektory z matrycą diod

detektory z matrycą diod

Detektor

Detektor

spektrofluorymetryczny

spektrofluorymetryczny



czuły wobec związków wykazujących

czuły wobec związków wykazujących

właściwości fluorescencyjne

właściwości fluorescencyjne



Detektor selektywny

Detektor selektywny



łączy się go z detektorem

łączy się go z detektorem

absorpcyjnym

absorpcyjnym

Detektor refraktometryczny

Detektor refraktometryczny



po detektorze

po detektorze

spektrofotometrycznym najczęściej

spektrofotometrycznym najczęściej

używany

używany



mierzy w sposób ciągły różnice

mierzy w sposób ciągły różnice

współczynników załamania czystej

współczynników załamania czystej

fazy ruchomej i eluentów z kolumny

fazy ruchomej i eluentów z kolumny



detektor uniwersalny

detektor uniwersalny



wrażliwy na zmiany temperatury

wrażliwy na zmiany temperatury