WYSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA

HPLC - high performance liquid chromatography - wysokosprawna chromatografia cieczowa jest uniwersalną metodą analityczną, stosowaną głównie do analiz złożonych próbek, zwłaszcza zawierających nielotne, wielkocząsteczkowe związki chemiczne, w szczególności substancje biologiczne czynne.

Metoda HPLC wykorzystuje efekt rozdziału chromatograficznego z użyciem cieczy jako fazy ruchomej. Skład fazy ciekłej i rodzaj fazy stacjonarnej jest uzależniony od składu badanych próbek oraz typu oddziaływań wykorzystywanych do osiągnięcia separacji ich składników. HPLC różni się od zwykłej chromatografii cieczowej ciśnieniem, pod jakim podawany jest eluent na kolumny. Są to dość znaczne ciśnienia, przekraczające 100 atmosfer. Dzięki takiemu ciśnieniu złoże w kolumnach HPLC może być bardziej "upakowane" niż w kolumnach do zwykłej, niskociśnieniowej chromatografi cieczowej, co powoduje znacznie lepszy rozdział analizowanych mieszanin na poszczególne związki chemiczne, w znacznie krótszym czasie, przy mniejszym zużyciu eleunta i mniejszej ilości analizowanej próbki.

Współczesna HPLC, wprowadzona w 1960 r. okazała się najbardziej prężnie rozwijającą się techniką chromatograficzną i znalazła szerokie zastosowanie w analizie preparatów farmaceutycznych, analizie biochemicznej, klinicznej i środowiskowej.

[4]

Aparatura w analizie HPLC

Podstawowe części chromatografu cieczowego to:

1. zbiornik (zbiorniki) fazy ruchomej,

2. filtr,

3. pompa,

4. manometr,

5. dozownik,

6. kolumna,

7. termostat,

8. detektor,

9. wzmacniacz,

10. rejestrator, komputer,

11. automatyczny dozownik,

12. kolektor frakcji

Ideowy schemat chromatografu cieczowego rys. 1

[2]

Zasada działania chromatografu cieczowego:

Ze zbiornika lub zbiorników pompą tłoczy się do kolumny, wypełnionej fazą stacjonarną (nieruchomą) fazę ruchomą (kolumna jest niekiedy umieszczana w termostacie). Faza ruchoma nazywana też eluentem, to pojedynczy rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników. Między pompą a kolumną znajduje się dozownik. Za pomocą dozownika do strumienia cieczy wprowadza się próbkę, której składniki rozdzielają się w kolumnie i na wyjściu z niej są wykrywane przez detektor. Sygnał elektryczny z detektora, po wzmocnieniu, jest rejestrowany za pomocą integratora albo komputera w postaci piku chrotnatograficznego.

Zwykle ustawia się wymagany przepływ fazy ruchomej przez układ i mierzy się odpowiadające mu ciśnienie na wlocie do kolumny. Jest możliwe zbieranie rozdzielonych składników mieszanin znajdujących się w eluencie. Niektóre przyrządy są wyposażone w tym celu w kolektory frakcji. [1]

Zbiorniki fazy ruchomej

Są to najczęściej butle szklane służące do przechowywania fazy ruchomej. Cza­sami wbudowane są w pompy, np. w przypadku pomp strzykawkowych. Zaopatrzone są w układ filtracyjny z filtrami o średnicy poniżej 0,5 μm, układ odgazowania umożli­wiający usuwanie powietrza (tlenu) przez gotowanie lub przepłukiwanie helem.

Pompy

Pompa jest ważną częścią chromatografu cieczowego, ponieważ po­woduje przepływ fazy ruchomej z optymalną prędkością przez wypeł­nienie kolumny stawiające duże opory.

Dobre pompy powinny się charakteryzować:

• stałym przepływem fazy ruchomej z możliwością regulacji w granicach 0,5-10 cm³ · min^-1,

• odpornością chemiczną materiału pompy na fazy ruchome,

• małą objętością wewnętrzną,

• bezpulsacyjnym przepływem,

• możliwością uzyskania ciśnień roboczych do 35 MPa.

Podział pomp stosowanych w HPLC:

[2]

Dozowniki

Chromatografy cieczowe są wyposażone w dozowniki umożliwiające wprowadzanie próbek pod ciśnieniem atmosferycznym do kolumny, w której panuje ciśnienie do kilkudziesięciu MPa. Dozowniki powinny być tak konstruowane, żeby nie było w nich przestrzeni martwych tzn. nie przemywanych fazą ruchomą. Zły dozownik lub złe dozowanie może być przyczyną pojawiania się źle rozdzielonych, szerokich i niesymetrycznych pików.

[1]

Wyróżnić można kilka typów dozowników:

• typu strzykawkowego

• typu zaworów z pętlą,

• typu pętli ze strzykawką

[2]

Kolumny

Kolumna wraz z wypełnieniem stanowi element układu chromatograficznego, w którym zachodzi właściwy proces rozdziału.

W zależności od wielkości próbki możemy wybrać dla HPLC:

• mikrokolumny,

• kolumny analityczne

• kolumny preparatywne.

Do celów analitycznych z reguły stosuje się kolumny analityczne. Są to najczęściej rurki ze stali nierdzewnej o wypolerowanej powierzchni wewnętrznej długości od 5 do 35 cm i średnicy wewnętrznej 4,6mm (długość kolumny będzie zależeć od średnicy ziaren wypełnienia - im ziarno mniejsze, tym kolumna krótsza). [2]

Wypełnienia kolumn

W wysokosprawnej chromatografii cieczowej kolumnowej stosuje się najczęściej wypełnienia o rozmiarze ziaren 5-10 μm. Cząstki mniejsze od 3 μm nie są stosowane, gdyż powodują zbyt duże opory przepływu fazy ruchomej. Drobnoziarniste wypełnienia zapewniają krótką drogę dyfuzji cząsteczek substancji chromatografowanych do wnętrza ziaren i dzięki temu przy względnie dużych prędkościach fazy ruchomej uzyskuje się wysokie sprawności kolumn.

W chromatografii adsorpcyjnej stosuje się wypełnienia kolumnowe o różnej polarności. Spośród polarnych wypełnień kolumnowych stosuje się przede wszystkim żel krzemionkowy. Bardzo rzadko jest używany tlenek glinu i inne polarne adsorbenty które są przydatne tylko w pewnych szczególnych przypadkach rozdzielania. [1]

Chemiczna struktura powierzchni żelu krzemionkowego jest związana z obecnością na jego powierzchni grup silanolowych ≡(SiOH) lub siloksanowych (≡Si−O−Si≡) i może byc przedsta­wiona następującym schematem:

Obecnie dużo większe znaczenie niż żel krzemionkowy mają wypełnienia otrzymane przez jego modyfikację. Modyfikacja polega na związaniu z aktywnymi grupami żelu krzemionkowego związków organicznych. [1]

Fazy ruchome

Fazy ruchome w chromatografii cieczowej stanowią pojedyncze rozpuszczalniki lub ich dwu- albo więcej składnikowe mieszaniny. Zwykle nie ma potrzeby stosowania mieszanin o większej liczbie składników niż trzy, chociaż w szczególnych przypadkach taka konieczność może zaistnieć.

Faza ruchoma, którą wprowadza się do kolumny, nosi nazwę eluentu. W kolumnie w skład fazy ruchomej oprócz eluentu mogą wchodzić także składniki rozdzielanej mieszaniny. Po rozdzieleniu te składniki są obecne w wycieku z kolumny, który nosi nazwę eluatu.

Skład eluentu może być jednakowy lub może się zmieniać w trakcie chromatografowania próbki.

Ogólna zasada wyboru eluentu jest taka, że analizę substancji niepolarnych (np. węglowodorów i ich pochodnych halogenowych lub związków tlenowych zawierających duże rodniki węglowodorowe), które rozpuszczają się dobrze w heksanie, wykonuje się zwykle w odwróconym układzie faz (faza ruchoma jest bardziej polarna od fazy stacjonarnej). W tym przypadku stosuje się fazę ruchomą zawierającą 0 - 30% wody w metanolu lub acetonitrylu. Do rozdzielania bardzo słabo polarnych związków można stosować mieszaninę acetonitryl-chloroform lub acetonitryl-chlorek metylenu. Substancje o pośredniej polarności rozpuszczają się w estrach, alkoholu i chloroformie. Te związki mogą oddziaływać z grupami aktywnymi żelu krzemionkowego i polarnymi grupami faz związanych a żelem krzemionkowym. Do ich analizy w normalnym układzie faz (faza ruchoma jest mniej polarna od fazy stacjonarnej) stosuje się mieszaniny zawierające 2-50% organicznego rozpuszczalnika polarnego w rozpuszczalniku niepolarnym (mp. węglowodorze lub halogenowęglowodorze). [1]

Chromatografia w normalnym i odwróconym układzie faz

Na przebieg i efekty rozdzielania chromatograficznego analizowanej mieszaniny wpływają właściwości układu faza stacjonarna - faza ruchoma.

Tabela Różnice pomiędzy układami faz w chromatografii. [1]

	Chromatografia w normalnym układzie faz	Chromatografia w odwróconym układzie faz
Właściwości fazy stacjonarnej	Silnie polarne fazy stacjonarne	Słabo polarna lub niepolarna
Rodzaj najczęściej stosowanej fazy stacjonarnej	Żel krzemionkowy	Niepolarne, hydrofobowe wypełnienia
Właściwości fazy ruchomej	Mniej polarna niż faza stacjonarna	Bardziej polarna od fazy stacjonarnej
Rodzaj najczęściej stosowanej fazy ruchomej	heksan, izooktan, chloroform, chlorek metylenu.	tetrahydrofuran, acetonitryl, metanol woda mieszaniny acetonitrylu lub metanolu i wody.
Charakterystyka rozdziału	Związki bardziej polarne będą zatrzymywane dłużej na podłożu stacjonarnym kolumny w porównaniu do związków mniej polarnych.	Związki niepolarne i słabopolarne będą zatrzymywane dłużej na podłożu stacjonarnym kolumny w porównaniu do związków polarnych.

Detektory

Dobry detektor do HPLC powinien charakteryzować się:

• dobrą czułością i małą wartością granicy oznaczalności,

• uniwersalnością wskazań w stosunku do dużej liczby substancji lub selektywnością w stosunku do określonej liczby substancji,

• szerokim zakresem liniowości wskazań,

• małą objętością molową,

• niewrażliwością na zmiany temperatury i zmiany prędkości przepływu fazy ruchomej,

• łatwością obsługi i niezawodnością działania.

[2]

Zastosowanie wysokosprawnej chromatografii cieczowej [2]

Metoda HPLC ma zastosowanie zarówno w analizie jakościowej, jak i ilościowej złożonych mieszanin różnych klas związków. Analiza jakościowa polega na identyfi­kacji pików odpowiadających poszczególnym składnikom próbki. Ilo­ściową zawartość składników w próbce oblicza się, wykorzystując fakt, że powierzchnia piku lub jego wysokość jest proporcjonalna do ilości danego składnika w próbce. W ana­lizie wykorzystuje się porównanie wysokości (powierzchni) piku próbki z wysokością (powierzchnią) piku wzorca. Współczesne chromatografy zaopatrzone w komputer pozwalają w prosty sposób wykonać analizę ilościową.

Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa jest stosowana do rozdzielania i analizy takich związków jak:

• związki biologicznie czynne: białka, polipeptydy, aminokwasy, polisacharydy, witaminy, sterydy, kwasy nukleinowe i ich składniki;

• preparaty farmaceutyczne;

• środki ochrony roślin, pestycydy;

• węglowodory policykliczne, w tym rakotwórcze [benzo(a)piren] w powietrzu atmosferycznym, wodzie i w środkach spożywczych;

• związki metaloorganiczne i związki kompleksowe;

• aniony nieorganiczne metodą chromatografii jonów;

• skomplikowane mieszaniny kationów, np. rozdzielanie pierwiastków ziem rzadkich.

Oznaczanie związków fenolowych z zastosowaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej.

1

1

2

3

4

9

8

7

6

5

11

12

POMPY

Stałociśnieniowe

Stałoprzepływowe

- obecnie rzadziej stosowane w analizie HPLC

Wyporowe

Tłokowe

Zaletą tych pomp jest prosta konstrukcja i brak pulsacji ciśnienia, a wadą możliwość niepożądanych zmian przepływu fazy ruchomej.

Strzykawkowe

Tłokowe

Z jednym, dwoma lub rzadziej trzema tłokami

---