Chromatografia cieczowa- technika analityczna, w której fazą ruchomą (eluentem) jest ciecz (zwykle rozpuszczalnik). Polega na rozdzieleniu mieszaniny na związki przez rozpuszczenie przez stałe lub żelowe złoża (przypomina filtrację). Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych jedne przechodzą szybciej, inne wolniej.
Wady: -długi czas analizy, -mała rozdzielczość, -duże zużycie eluentu.
Podział chromatografii cieczowej:
- ze względu na stan skupienia (rodzaj) fazy nieruchomej (stacjonarnej):
1) ciecz-ciało stałe LSC (chromat. adsorpcyjna),
2) ciecz-ciecz LLC (rzadko stosowana, ponieważ ciecze wzajemnie mieszają się między sobą) stosuje się jej odmianę, gdzie faza stacjonarna- ciecz związana jest chemicznie z nośnikiem: krzemionką ( tzw. podziałowa),
3) jonowymienna IC- analiza związków jonowych, podstawą rozdzielenia są różnice w sile oddziaływań międzycząsteczkowych między jonami z r-ru, a jonami związanymi z fazą stacjonarną (jonitami)- subst. nierozpuszczalne wielkocząsteczkowe o budowie jonowej. Jako fazy ruchome stosuje się r-ry buforowe. Czynnikiem decydującym o mocy elucyjnej jest pH r-ru, o retencji (zatrzymaniu) związków decyduje wymiana jonowa.
4) powinowactwa,
5) żelowa (sitowa)- rozdzielanie następuje w wyniku różnicy mas cząsteczkowych.
O rozdzieleniu decydują wymiary rozdzielanych cząsteczek. Im mniejsze są wymiary cząst., tym głębiej penetrują ziarna żeli i wolniej migrują wzdłuż kolumny. Zależność między M, a obj. elucji V_R:
V[R]= -B log M + C; B,C-stałe
Eluent- faza ruchoma, rozpuszczalnik o niskiej masie cząst., który nie reaguje ze złożami, przechodzi przez nie bez oporów przepływu.
Fazy chiralne stacjonarne w HPLC- chemicznie związane z krzemionką o małej średnicy ziaren, umożliwiają rozdzielenie mieszaniny racemicznej, optycznie czynnych izomerów, ponieważ optycznie czynne fazy stacjonarne wiążą silniej jeden z enancjomerów.
Wypełnienia kolumn w HPLC:
-na bazie krzemionki,
-na bazie żywic porowatych.
Wypełnienia ze wzgl. na ziarna krzemionki:
-duże ziarna z głębokimi, szerokimi porami w całej masie,
-powierzchniowo porowate,
-małe ziarna, mała średnica ziaren, o mikroporach w całej masie ziarna.
Fazy stacjonarne związane z krzemionką (nośnikiem): mikroporowata krzemionka o małych ziarnach. Fazy mogą mieć różny charakter chemiczny. Najczęściej stosowane wypełnienia:
- z niepolarnymi grupami- na powierzchni krzemionki naniesione są niepolarne grupy, odwrócony układ faz (RP-LC)- faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza ruchoma, np. fenylowa, -CH₃, -C8H17.
-z polarnymi grupami- na powierzchni krzemionki naniesione są grupy polarne, np. R-NH2, -R-NO2, -R-CN, -R- OH; w normalnym układzie faz (NP-LC), gdzie faza stacjonarna jest bardziej polarna niż ruchoma.
-z grupami jonowymiennymi- zastosowanie w chrom. jonów IC,
-z grupami optycznie czynnymi- (chiralne stany stacjonarne) rozdzielają mieszaniny racemiczne.
Rodzaje faz stacjonarnych:
-chemicznie związane typu :
+NP(hydrofilowe) polarne, ruchome, mniej polarne niż stacjonarne; faza normalna, np. grupa aminowa, nitrowa, CN; eluent to n-heksan.
+ RP (hydrofobowe), niepolarne, ruchome , bardziej polarne niż stacjonarne, faza odwrócona, np fenylowa,C8, C18, jako eluent stosuje się mieszaniny metanol-woda.
- faza stacjonarna nieorganiczna, np. żel krzemionkowy, tlenek glinu rzadziej, ditlenek tytanu, krzemian magnezu.
Typy układów:
-odwrócony układ faz (RP-LC)- na powierzchni krzemionki naniesione są niepolarne grupy, faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza ruchoma, np. fenylowa, -CH₃, -C8H17.
-normalny układ faz (NP-LC), na powierzchni krzemionki naniesione są grupy polarne, np. R-NH2, -R-NO2, -R-CN, -R- OH; faza stacjonarna jest bardziej polarna niż ruchoma.
Faza ruchoma- rozpuszczalnik, eluent w HPLC; wywiera decydujący wpływ na zdolność rozdzielczą układu. W HPLC powinnya: -wykazywać odpowiednią zdolność rozpuszczania próbki, -umożliwiać detekcję próbki, -być tania, -nie reagować chemicznie ani z fazą stacjonarną, ani z rozdzielaną próbką, -trwała w warunkach chromatografowania, -być czysta.
Chromatografia cieczowa HPLC:
rodzaj chromatografii cieczowej kolumnowej, wysokosprawna, wysokociśnieniowa, szybka, o dużej rozdzielczości. Cel: do badania czystości, identyfikowania i oczyszczania substancji. Używane substancje: o temp. wrzenia powyżej 350-400, te które łatwo się rozkładają termicznie, np. polimery, zw. nieorganiczne, są trudne lub niemożliwe do analizy GC, nietrwałe w podwyższonych temp., warunek: ich rozpuszczalność! Zastosowanie: -analiza ilościowa: wykorzystuje fakt, że pow. piku lub wysokości jest proporcjonalna do ilości składnika w próbce, -analiza jakościowa: identyfikuje się piki przez porównanie czasu retencji piku identyfikowanej substancji z czasem retencji piku wzorca, -w analizie związków niemożliwych lub trudnych do rozdzielenia za pomocą GC, -oznaczanie związków biologicznie czynnych: białka, sterydy, witaminy, -analiza preparatów farmaceutycznych, -w analizie klinicznej, środowiskowej, toksykologicznej, -wykrywanie środków ochrony roślin, zwłaszcza trudno lotnych, -analiza wody w stacjach wodociągowych. Próbka jest rozpuszczana w rozpuszczalniku (ciecz), roztwór o znanym C i V kieruje się na kolumnę, wypełniona złożem porowatym lub żelowym. Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych następuje ich rozdział. Część cząst. ulega retencji (zatrzymaniu). HPLC różni się ciśnienie od zwykłej chrom. pod jakim podawany Est eluent na kolumny (ponad 100 atm). Duże znaczenie ma polarność faz.
Budowa i działanie chromatografu HPLC:
Fazę ruchomą pompuje się ze zbiornika (po filtracji i odgazowaniu) przez kolumnę chromatograficzną. Analizowana próbkę wstrzykuje się na szczyt kolumny. Składniki próbki rozdzielają się w kolumnie i na wyjściu z niej są wykrywane przez detektor. Sygnał z detektora jest zapisywany na taśmie rejestratora lub/oraz mierzony integratorem i przekazywany w postaci zapisu cyfr. Jest też obróbka komputerowa danych.
Podstawowe części HPLC: -zbiornik fazy ruchomej, -filtr, -pompa, -manometr, -dozownik, -kolumna, -termostat, -detektor, -wzmacniacz, -rejestrator, -komputer.
Zbiorniki- butle szklane do przechowywania fazy ruchomej. Mają układ filtrujący z filtrami i odgazowujący (powietrze przez gotowanie, przepłukiwanie helem).
Pompy- w sposób ciągły, odtwarzalny i z optymalną prędkością powodują przepływ fazy ruchomej przez kolumnę. Powinny charakteryzować się: stałym przepływem fazy ruchomej, odpornością chemiczną, małą obj. wewn., bezpulsacyjnym przepływem, możliwością uzyskania ciśń. roboczych do 35MPa. Rodzaje: 1) stałociśnieniowe: rzadko stosowane: -wyporne, -z tłokami. Prosta konstrukcja i brak pulsacji ciśnienia. 2) stało przepływowe: często stosowane: -strzykawkowe (bezpulsacyjne, wada: mała ilość fazy ruchomej, więc należy zatrzymywać prace w celu dopełnienia), -tłokowe (najpowszechniejsze, wytwarz. ciśn. zasięgu 50 MPa).
Wysokie ciśnienie jest konieczne, bo średnica nośnika chromatografu jest bardzo mała w stosunku do fazy stacjon. Im jest ona mniejsza, tym większa powierzchnia czynna i lepszy rozdział. Pozwala to na identyfikację i rozdział składników mieszaniny jednocześnie z zachowaniem wysokiej dokładności. Cecha ta stwarza konieczność stosowania wysokich ciśnień podczas przepływu fazy ruchomej. Wysokie ciśnienie pozwala ‘przepchnąć’ bardzo dużo ilość małych kulek, fazę ruchomą przez sorbent w kolumnie.
Dozowniki: wprowadzają próbkę przez bardzo wąskie pasma do kolumny. Typy: -strzykawkowe, -zaworów z pętlą, - pętli ze strzykawką.
Kolumny: zachodzi w niej właściwy proces rozdziału. Rodzaje: -mikrokolumny, -analityczne, -preparatywne. Są to rurki ze stali ze stali nierdzewnej o wypolerowanej pow. wewn. Dł. zależy o średnicy ziaren wypełnienia. Im ziarna mniejsze, tym kolumna krótsza. Są zamknięte z dwóch końców filtrami i łącznikiem łączącym dozownik i detektor. Można je napełnić techniką suchą i mokrą. Zawierają sorbent.

1. Detektory: instrument mierzący stężenie albo strumień masy substancji w ekranie wypływającym z kolumny i przepływającym przez naczynie pomiarowe detektora. Cechy: -duża czułość i mała wartość granicy oznaczalności, -mała objętość molowa, -łatwa obsługa i niezawodne działania, -niewrażliwość na zmiany temp. i prędkości przepływu fazy ruchomej, -szeroki zakres liniowości wskazań.
Rodzaje: 1) mierzące właśc. charakterystyczne dla próbki: -spektroskopowe: spektrofotometryczne, spektrofluorymetryczne, spektroskopii atomowej, - elektrochemiczne: amperometryczne, woltametryczne, kulometryczne, potencjometryczne, -radioaktywacyjne.
2) mierzące wł. wspólne dla próbki i fazy ruchomej: -refraktometryczny, -konduktometryczny, -adsorpcyjny.
- spektrofotometr UV– działa na zasadzie absorpcji prom. UV; umożliwia rejestrację widma absorpcji substancji znajdującej się w detektorze i ustalenie długości fali przy której występuje maksimum absorpcji. Stosunek wartości absorbancji pokazuje nam ilość związków chemicznych w detektorze. Typy: -pracujące przy jednej dł. fali 254 nm, dla której zw. organ. absorbuję prom. UV, -pracujące w zakresie UV a nawet Vis, -detektory typu diode array.
-fluorescencyjny- wykonuje pomiar intensywności promieniowania o określonej długości fali, emitowanego przez wykrywany związek w wyniku jego pobudzenia. Stosuje się tylko do związków które mają zdolność do fluorescencji, np. związki aromatyczne. Jest bardzo czuły i łatwy w stosowaniu.
-refraktometryczny – mierzy różnicę współczynnika załamania światła czystej fazy ruchomej i eluentu z kolumny, stosuje się do wykrywania cukrów, alkoholi. Wrażliwy na zmiany temp.
2. Typy układów:
-odwrócony układ faz (RP-LC)- na powierzchni krzemionki naniesione są niepolarne grupy, faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza ruchoma, np. fenylowa, -CH₃, -C8H17.
-normalny układ faz (NP-LC), na powierzchni krzemionki naniesione są grupy polarne, np. R-NH2, -R-NO2, -R-CN, -R- OH; faza stacjonarna jest bardziej polarna niż ruchoma.
Fazy stacjonarne związane z krzemionką (nośnikiem): mikroporowata krzemionka o małych ziarnach. Fazy mogą mieć różny charakter chemiczny. Najczęściej stosowane wypełnienia:
- z niepolarnymi grupami- na powierzchni krzemionki naniesione są niepolarne grupy, odwrócony układ faz (RP-LC)- faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza ruchoma, np. fenylowa, -CH₃, -C8H17.
-z polarnymi grupami- na powierzchni krzemionki naniesione są grupy polarne, np. R-NH2, -R-NO2, -R-CN, -R- OH; w normalnym układzie faz (NP-LC), gdzie faza stacjonarna jest bardziej polarna niż ruchoma.
-z grupami jonowymiennymi- zastosowanie w chrom. jonów IC,
-z grupami optycznie czynnymi- (chiralne stany stacjonarne) rozdzielają mieszaniny racemiczne.
Rodzaje faz stacjonarnych:
-chemicznie związane typu :
+NP(hydrofilowe) polarne, ruchome, mniej polarne niż stacjonarne; faza normalna, np. grupa aminowa, nitrowa, CN; eluent to n-heksan.
+ RP (hydrofobowe), niepolarne, ruchome , bardziej polarne niż stacjonarne, faza odwrócona, np fenylowa,C8, C18, jako eluent stosuje się mieszaniny metanol-woda.
3. Wysokie ciśnienie jest konieczne, bo średnica nośnika chromatografu jest bardzo mała w stosunku do fazy stacjon. Im jest ona mniejsza, tym większa powierzchnia czynna i lepszy rozdział. Pozwala to na identyfikację i rozdział składników mieszaniny jednocześnie z zachowaniem wysokiej dokładności. Cecha ta stwarza konieczność stosowania wysokich ciśnień podczas przepływu fazy ruchomej. Wysokie ciśnienie pozwala ‘przepchnąć’ bardzo dużo ilość małych kulek, fazę ruchomą przez sorbent w kolumnie.
Sprawność kolumny (ilość półek) – zdolność kolumny do wytwarzania wąskich pików, jej miarą jest ilość półek. Decyduje czy pik jest ostry czy rozmyty. Charakteryzuje się wysokością półek H (wysokością równoważną półce WRP- najmniejsza długość odcina kolumny, w której osiąga się stan równowagi między stężeniami subst. chromatografowanej w fazie ruchomej i nieruchomej). H=L/N. Im mniejsze H, tym więcej N i kolumna sprawniejsza. N= 5,55*(tR/W1/2)^2, gdzie tR’=tR-tM.
Wydajność zależy od wielkości cząstek wypełnień kolumn ( od sorbentu, czyli np. o żelu krzemionkowego, który ma dużą średnicę). Im większa średnica, tym większa wydajność.
4. Gradientu stężenia w HPLC: stosujemy w elucji gradientowej. Wartość gradientu: szybkość z jaką w fazie ruchomej rośnie stężenie rozpuszczalnika o większej mocy elucyjnej. Elucja gradientowa ma szerokie zastosowanie w przypadku chromatografowania mieszanin złożonych, zawierających składniki różniące się znacznie polarnością, jest niezbędna przy rozdziale białek i peptydów w RP HPLC. Proces zaczyna się elementem o małej mocy elucyjnej, a następnie dodając rozpuszczalnika o dużej mocy elucyjnej, zwiększa się moc mieszaniny. Cel: zaoszczędzanie czasu.
Współczynnik retencji k: stosunek ilości substancji w fazie stacjonarnej do ilości substancji w fazie ruchomej. Im większa wartość k, tym silniej substancja oddziałuje z wypełnienie kolumny. k=Cst*Vst/ Cm*Vm.
Współczynnik rozdzielania (selektywności): miara rozdzielenia dwóch sąsiednich pików, α= tR2-tM/(tR1-tM).

1. Całkowity czas retencji tR: czas jaki upływa między wprowadzeniem próbki, a pojawieniem się maksimum piku rozpatrywanego składnika próbki. To suma czasu w którym substancja oddziałuje z wypełnieniem kolumny i czasu potrzebnego do przejścia substancji od dozownika do detektora.
Czas zredukowany retencji tR’: to czas, w którym substancja oddziałuje z wypełnieniem kolumny: tr`=tr-tm
(czas zred= czas całk retencji – czas martwy ( przejście czystego rozpuszczalnika, czas retencji substancji niezatrzymanej lub zerowy czas retencji/ składnik niezatrzymany przez fazę stacjonarną wycieka w czasie tM)
2. Elucja gradientowa: (zmiana składu eluentu w czasie). Ma szerokie zastosowanie w przypadku chromatografowania mieszanin złożonych, zawierających składniki różniące się znacznie polarnością, jest niezbędna przy rozdziale białek i peptydów w RP HPLC. Proces zaczyna się elementem o małej mocy elucyjnej, a następnie dodając rozpuszczalnika o dużej mocy elucyjnej, zwiększa się moc mieszaniny. Cel: zaoszczędzanie czasu.
Elucja izokratyczna: skład eluentu jednakowy przez cały czas, eluent o stałym składzie jest pompowany w trakcie całego procesu rozdzielania. Stosowana może być faza ruchoma jednoskładnikowa lub mieszanina o stałym składzie jakościowym i ilościowym. Metodę elucji izokratycznej stosuje się przede wszystkim do rozdzielania mieszaniny jonów o zbliżonej polarności.
3. Izoterma sorpcji:
Przedstawia zależność między stężeniem substancji chromatografowanej ( sorbatem) w fazie stacjonarnej, a stężeniem sorbatu w fazie ruchomej, przy T=const.

4. Półka teoretyczna: charakteryzuje się określonym stanem równowagi termodynamicznej, ustalonym między fazami.
Objętość kolumny, w której zostaje osiągnięty stan równowagi miedzy st. substancji chromatografowanej w fazie ruchomej i stałej. Wysokość równoważna półce WRP- najmniejsza długość odcina kolumny, w której osiąga się stan równowagi między stężeniami subst. chromatografowanej w fazie ruchomej i nieruchomej). H=L/N. Im mniejsze H, tym więcej N i kolumna sprawniejsza. N=5,55*(tR/W1/2)^2, gdzie tR’=tR-tM.
5. Wykres zależności wysokości półki od prędkości przepływu: