Podstawę klasyfikacji metod chromatograficznych mogą stanowić: 1) stan skupienia fazy ruchomej (chromatografia gazowa, ch. Cieczowa, ch. Fluidalna) 2) stan skupieni fazy stacjonarnej (fazą ta może być ciecz na nośniku lub ciało stałe czyli chromatografia w układzie: gaz-ciecz, ciecz-ciecz, gaz-ciało stałe, ciecz-ciało stałe. 3) natura zjawisk będących podstawa procesu ch (oddziaływania na granicy faz, wykorzystywane są: adsorpcja, podział subst między dwie niemieszające się ciecze, wymiana jonowa, powinowactwo chem, efekty sitowe) w ten sposób wyróżnia się: a) chromatografię adsorpcyjną- rozdział możliwy jest różnym powinowactwem adsorpcyjnym składników mieszaniny do odp dobranej pow fazy stacjonarnej zwanej adsorbentem. B) ch. Podziałową- rozdział oparty jest na różnicy w wartościach współczynnika podziału skl mieszaniny między dwie nie mieszające się fazy z których jedna jest fazą stacjonarną (ciecz) osadzona na nośniku a druga faza ruchomą (ciecz, fluid, gaz).c) Ch. Jonowymienną- podstawe rozdziału stanowią reakcje wymiany jonowej między jonami z r-ru a jonami związanymi z fazą stacjonarną która stanowia jonity( nierozp subst wielocząsteczkowe o budowie jonowej zdolne do wymiany jonów) d) ch. Sitowa (żelowa) o rozdziale decyduje rozmair czastek. Cząsteczki o małych rozmaiarach wnikają w pory żelu , im mniejsze rozmiary cząst. Tym wolniej migrują wzdłuż komuny. Rozdział zachodzi na skutek różnicy mas cząsteczkowych rozdzielanych zw.

TECHNIKI EKSPERYMENTALNE: •technika kolumnowa- stosowana we wszystkich metodach chr. •technika planarna możliwa tylko w ch cieczowej którą dzieli się na ch. Cienkowarstwowąi ch. Bibułową.

Podstawą rozdzielenia chromatograficznego jest fakt że poszczególne składniki próbki w niejednakowym stopni ulegają podziałowi między dwie fazy nie mieszającesię0 fazę ruchomą i stacjonarną (ciecz). Prędkość poruszania się składników próbki w kolumnie jest funkcją podz tych składników w dwu pozostających w stanie równowagi fazach przy czym składniki wykazujące większe powinowactwo do fazy stacjonarnej poruszają się wolniej niż składniki wykazujące większe powinowactwo do fazy ruchomej. Rozdzieelnie jest wynikiem różnych szybkości migracji, spowodowanej różnymi wartościami współczynnika podziału K ( K= Cs/Cm, Cs,Cm to stęż subst X w fazie stacjonarnej i ruchomej).

Sprawność kolumn chromatograficznych. O tym czy pik ch jest ostry czy rozmyty decyduje sprawność kolumny. O sprawności kolumny mówi tzw. Wysokość równoważna półce teoretycznej. Przez pojęcie półki teoretycznej rozumie się objętość kolumny w której zostaje osiągnięty stan równowagi między steż subst chromatografowanej w fazie ruchomej i nieruchomej. Kolumna ch składa się z N hipotetycznych półek teoretycznych L=NH (L-dł kolumny, H- wys równoważna półce teoretycznej. Po wprowadzeniu subst na pierwszą półkę ulega ona podziałowi między fazę ruchomą i stacjonarną, zgodnie z wartościami współczynnika K. sprawność kolumny możn zwiększyć obniżając wartość H przez: dobór optymalnej prędkości przepływu fazy ruchomej i taki dobór kolumny i jej wypełnienia aby wartości ABC w równaniu van Deemtera (H= A+B/u +Csu) były możliwie małe.

APARATURA DO CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ (HPLC)

W chr. Cieczowej posugujemy sie kolumnami szklanymi, a wyciek analizujemy za pomocą konwencjonalnych metod analizy. Analizę wykonuje się w chromatografach cieczowych. Fazę ruchomą ze zbiornika pompuje się przez kolumne chromatogr. Analizowana próbkę wstrzykuje się naszczyt kolumny. Skladniki probki rozdzielaja sie w kolumnie i na wyjsciu z niej wykrywane są przez detektor. Sygnał z detek. Jest zapisywany w rejestratorze, mierzony integratorem i przekazywany w postaci zapisu cyfrowego.

Schemat chromatografu cieczowego: zbiornik fazy ruchomej > filtr> pompa> manometr.dozownik> kolumna> termostat> detektor> wzmacniacz> rejestrator> komputer

Pompy – w sposob ciągły, odtwarzalny i z optymalną prędkościa powodują przepływ fazy ruchomej przez kolumnę. Powinny charakteryzowac się: *stałym przepływem fazy ruchomej , *odpornością chemiczną materiału pompy na fazy ruchome, *małą objętością wewnętrzną, *bezpulsacyjnym przepływem, *możliwością uzyskania ciśnień roboczych do 35MPa. Kategorie ukł. pompujących: *stałociśnieniowe (-pompy wyporowe (cisnienie wytwarzane przez gaz z butli), -pompy z tłokami o róznej srednicy z napędem pneumatycznym. Zalety: posta konstrukcja, brak pulsacji cisnienia, wady: mozliwosc niepozadanych zmian przepływu fazy ruchomej), *stałoprzepływowe (-strzykawkowe (pracuja bezpulsacyjnie, ich wada jest mała ilosc fazy ruchomej zuzywanej w jednym cyklu pracy – koniecznosc przerywania procesu w celu napelnienia cylindra rozpuszczalnikiem); -tłokowe (najczesciej stosowane, yłoki przesuwaja sie w cylindrach o małej objętosci, ruch tłokow jest zsynchronizowany z otwieraniem i zamykaniem zaworów kulkowych kotrolujących przepływ f. ruchomej. Ich wada jest pulsacja cieczy powodujaca niestałości linii zerowej)

Dozowniki – próbkę do kolumny należy wprowadzac w postaci bardzo wąskiego pasma (pozakolumnowe poszerzenie pasma ma istotny wpływ na wartośc współczynnika retencji k). Typy dozownikow: *typu strzykawkowego,(umozliwiaja wprowadzenie probki bezposrednio do kolumny, -z uszczelkami, -bez uszczelek) *typu zaworu z pętlą (umożliwiaja wprowadzenie próbek w szerokim zakresie objętosci i z dobra odtwarzalnością), *typu pętli ze strzykawką

Kolumny – zachodzi w niej właściwy proces rozdziału, w zależności od wielkości próbki możemmy wybrac dla HPLC mikrokolumny, kolumny analityczne i kolumny preparatywne. Długośc kolumny zależy odziaren wypełnienia. Im ziarno mniejsze tym kolumna krótsza.

Detektory – powinny charakteryzowac się; *dobrą czułością i małą wartością granicy oznaczalności, *uniwersalnością wskazań w stosuknku do dużej licby substancji lub selektywnościa w stosunku do określonej liczby substancji, *szerokim zakresem liniowości wskazań, *małą objętością molową, *niewrażliwością na zmiany temp. i zmiany prędkości przepływu f. ruchomej, *łatwością obsługi i niezawodnością działania. Detektory dla HPLC można podizelic na 2 gr.: *det. W ktorych nastepuje pomiar własciwosci charakt. dla probki, *det., w ktorych nastepuje pomiar własciwosci wspolnej dla probki i f. ruchomej. Wybrane detektory stosowane w HPLC: *detektor spektofotometryczny UV – dziala na zasadzie absorpcji promieniowania UV (pracujace przy jednej dł, fali; pracujace w calym zakresie UV a nawet Vis; typu diode array), *detektor spektrofluorometryczny (det. selektywny charakteryzujacy się dużą czułością w stosunku do zw. wykazujaych wł, fluorescencyjne), *detektor refraktometryczny (mierzy w sposob ciągły różnice współczynników załamania czystej fazy ruchomej i eluentu z kolumny, jest mniej czuły niz det. UV, wrażliwy na zmiany temp)

Zastosowanie chromatografii cieczowej:

Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa jest stosowana do rozdzielania i analizy tych substancji, których nie można analizować metodą GC lub których rozdzielanie ta metodą nastręcza duże trudności. Do najczęściej analizowanych tą metodą związków można zaliczyć: -związki biologicznie czynne(białka, aminokwasy); -preparaty farmaceutyczne; -środki ochrony roślin, pestycydy; -węglowodory policykliczne; -związki metaloorganiczne i kompleksowe; -aniony nieorganiczne metodą chromatografii jonów; -skomplikowane mieszaniny kationów np. rozdzielanie pierwiastków ziem rzadkich.

Metoda HPLC ma zastosowanie w ANALIZIE JAKOŚCIOWEJ, jak i ILOŚCIOWEJ złożonych mieszanin różnych klas związków.

Analiza jakościowa polega na identyfikacji pików odpowiadających poszczególnym składnikom próbki. Można tego dokonać przez:

1)porównanie czasu retencji próbki z czasem retencji wzorca

2)zastosowanie detektorów jakościowych, np. spektrometru mas. Detektor MS pozwala w sposób jednoznaczny zidentyfikować poszczególne piki chromatografu.

Analiza ilościowa w HPLC, tutaj ilościową zawartość składników w próbce oblicza się, wykorzystując fakt, że powierzchnia piku lub jego wysokość jest proporcjonalna do ilości danego składnika w próbce. W analizie wykorzystuje się porównanie wysokości(powierzchni) piku próbki z wysokością(powierzchnią) piku wzorca. Korzysta się przy tym z procedur opartych na metodzie wzorca wewnętrznego bądź zewnętrznego lub kalibracji bezwzględnej. Współczesne chromatografy zaopatrzone w komputer pozwalają w prosty sposób wykonać analizę ilościową.