Wprowadzanie grup

funkcyjnych do białek

Wprowadzanie grupy

sulfhydrylowej

Odczynnik Trauta (2-imidotiolan)
Rozpuszczalny w wodzie.
Reaguje z pierwszorzędowymi aminami w zakresie pH 7 -10.
Przebieg reakcji można śledzić spektrofotometrycznie. 2-

imidotiolan absorbuje światło λ

max

= 248 nm. W wyniku

reakcji dochodzi do spadku intensywności sygnału.

Odczynnik Trauta jest często wykorzystywany do otrzymywania

immunotoksyn.

Białka modyfikowane odczynnikiem Trauta są bardzo podatne na

utlenianie i mogą tworzyć disiarczki.

Dodanie EDTA do stężenia 0.1 M znacznie obniża utlenianie zależne od

metali.

Jest grupa związków modyfikujących, które wprowadzają tzw.

„chronione” grupy sulfhydrylowe. Zmodyfikowane białko może być
dzięki temu przechowywane przez dłuższy czas.

Aktywacja grupy

sulhydrylowej zachodzi bez udziału związków redukujących

, co

pozwala na zachowanie nienaruszonych natywnych disiarczków w
białku. Jest to istotne zwłaszcza gdy disiarczki są niezbędne do
zachowania aktywności białka (np. niektóre białkowe toksyny).

SATA (N-bursztynoimidylo S-acetylotiootan)
SATA jest często używane do konstrukcji koniugatów przeciwciało-enzym.

Większość przeciwciał poliklonalnych może być modyfikowane SATA
(nawet 6 cząsteczek SATA/cząsteczkę przeciwciała) bez widocznego
spadku powinowactwa do antygenu. Niektóre przeciwciała
monoklonalne mogą być wrażliwe na modyfikację SATA.

Często wykorzystuje się SATA do koniugacji z awidyną lub streptawidyną.

Aktywacja grup sulfhydrylowych zachodzi
w obecności nadmiaru hydroksyloaminy

Modyfikacja grup karboksylowych cystaminą

Cystamina jest mała cząsteczką zawierającą disiarczek,

zakończoną pierwszorzędowymi aminami.

Karbodiimid najpierw aktywuje
grupę karboksylową

Białko wyznakowane cystaminą można połączyć z innym białkiem zawierającym grupę
sulfhydrylową w reakcji wymiany disiarczku.

Cystamina może być także wykorzystana do połączenia 2 cząsteczek za pomocą swoich
końcowych reszt aminowych. Środkowy disiarczek jest zachowany – można rozdzielić
cząsteczki związkiem redukującym.

Wprowadzanie grup

karboksylowych

Wiele grup funkcyjnych, np. grupy aminowe, sulfhydrylowe, reszty

histydyny i metioniny, może ulec modyfikacji z wytworzeniem
grupy karboksylowej.

Wprowadzenie grupy karboksylowej zmienia ładunek netto

białka : zmiana pI; często wiąże się to nawet z utratą
aktywności białka.

Bezwodniki kwasów organicznych
Reagują z pierwszorzędowymi aminami, a także z grupami OH

seryny i tyrozyny, grupami SH i pierścieniem imidazolowym
reszt His.

Jodooctan
Może reagować z wieloma grupami funkcyjnymi w białku: grupami

SH reszt Cys, azotem pierścienia imidazolowego reszt His,
grupą tioeterową Met i pierwszorzędowymi aminami.

Jodooctan z reguły jest używany do blokowania grup reaktywnych.

Wprowadzanie pierwszorzędowych

grup aminowych

W większości przypadków białka zawierają wystarczającą ilość

grup aminowych odpowiednich do reakcji modyfikacji lub
sprzęgania. Zdarza się jednak, że pewne peptydy oraz białka
mają zbyt mało wolnych grup aminowych.

Takim przykładem jest peroksydaza chrzanowa (HRP) – tylko 2

wolne grupy aminowe.

Wprowadzenie dodatkowych grup aminowych zwiększa

efektywność sprzęgania.

Modyfikacje grup karboksylowych diaminami
Diaminy – związki zawierające pierwszorzędowe grupy aminowe

na obu końcach cząsteczki. W reakcji z grupą karboksylową
powstaje wiązanie amidowe, na końcu – wolna grupa aminowa.

Uwaga! Modyfikacja diaminami maże mieć ogromny wpływ na

całkowity ładunek białka i zmienia pI białka. Może mieć to
istotny wpływ na aktywność białka.

Blokowanie grup funkcyjnych

Cele:
1.

Ukierunkowanie reakcji koniugacji względem konkretnej
grupy funkcyjnej

2.

Zapobieganie niekontrolowanej polimeryzacji cząsteczek

3.

Zapobieganie utlenienia grup SH

4.

Zabezpieczanie grup funkcyjnych podczas reakcji sprzęgania
bifunkcjonalnymi związkami sieciującymi

5.

Zakańczanie reakcji sprzęgania lub modyfikacji.

Blokowanie grup aminowych

Octan sulfo-NHS
Wysoka reaktywność względem grup aminowych w pH 7-9.

prowadzi do acylacji amin; reakcja nieodwracalna.

Nie używać w buforach zawierających Tris, glicynę lub imidazol.

Zalecane bufory fosforanowe, boranowe, węglanowe.

Bezwodnik kwasu octowego
Acetylacja grupy aminowej w białku jest relatywnie

specyficzna jeżeli jest prowadzona w nasyconym roztworze
octanu sodu. W nadmiarze jonów octanowych pochodne O-
acetylotyrozyny są niestabilne. Pochodne tyrozyny
gwałtownie hydrolizują w zasadowym pH, nawet przy
braku jonów octanowych.

Dodanie hydroksyloaminy także powoduje rozpad

pochodnych O-acetylotyrozyny.

Blokowanie grup sulfhydrylowych

Są dwa typy związków blokujących: odwracalne i nieodwracalne.

Nieodwracalne prowadzą do wytworzenia wiązania tioeterowego.
Odwracalne blokują poprzez wytworzenie wiązania S-S i mogą być
usunięte odpowiednim związkiem redukującym.

N-etylomaleimid
Związek alkilujący reagujący z grupami SH – powstaje stabilne

wiązanie tioeterowe.

Reaguje specyficznie z grupami SH w pH 6.5-7.5

Pochodne jodooctanowe
Jodoacetamid – wykazuje najwyższą reaktywność względem grup SH.

Przy właściwie dobranym stosunku jodoacetamidu względem grup
SH i w lekko zasadowym pH, zachodzi wyłącznie modyfikacja
cystein.

Odczynnik Ellmana
Związek odwracalnie blokujący grupy SH.

Blokowanie grup karboksylowych

Związki zawierające grupę aminową, m.in. Tris lub

etanoloamina z udziałem karbodiimidu.