Mutageneza oparta na

reakcji PCR

Mutageneza

 Metoda wprowadzona wkrótce po odkryciu techniki PCR i

termostabilnych polimeraz (1988-1989)

 Mutageneza ukierunkowana:

- zamiana jednego lub kilku nukleotydów w określonym miejscu

sekwencji DNA

- delecja określonego fragmentu DNA
- insercja określonego fragmentu DNA

 Mutageneza przypadkowa:

- najczęściej zamiana różnych zasad w wielu miejscach

 Określenie ważności poszczególnych sekwencji – np. dla

struktury białka, aktywności katalitycznej, wiązania ligandów

 Określenie funkcji całego genu/białka
 Modyfikacja (ulepszenie) znanych białek

Cel mutagenezy

Ogólna zasada mutagenezy

ukierunkowanej wykorzystującej

oligonukleotydy jako nośniki

mutacji

 Syntetyczny oligonukleotyd (starter) zawierający

żądaną mutację przyłącza się do określonego regionu
matrycy DNA, gdzie zapoczątkowuje syntezę in vitro

 Polimeraza wydłuża oligonukleotydową sekwencję

syntetyzując podwójną nić DNA, zawierającą żądaną
mutację

 Zmieniony DNA jest włączany do odpowiedniego

miejsca w genie

 Weryfikacja mutacji (sekwencjonowanie)
 Selekcja zmutowanych klonów
 Ekspresja zmienionego białka i jego charakterystyka

NH

2

COOH

Asn-Xaa-

Ser/Thr

Przykład – mutageneza punktowa

miejsca N-glikozylacji

Mutacja miejsca nr 3 w triplecie aminokwasów (zamiana Ser lub
Thr na inny aminokwas, np. alaninę) – wykluczenie lub
potwierdzenie znaczenia glikozylacji

N-
glikan

Insercja
fragmentu DNA
do docelowego
genu

Gen z dodanym
fragmentem DNA

p

p

p

5’

Zamiana jednej lub kilku zasad

(substytucja)

Delecja

Insercja

Matryca – plazmid z
wklonowanym genem

PCR

DpnI, polimeraza DNA
Pfu

p

p

Pocięta
matryca i
hybryda DNA

Liniowy DNA

T4 ligaza DNA

ExSite PCR-

based Site-

directed

Mutagenesis

kit

(Stratagene)

p

Transformacja bakterii i
hodowla bakterii na
płytce

Zamiana jednej lub kilku zasad
(substytucja)

Delecja

Insercja

1. Denaturacja

plazmidu

2. Przyłączenie

starterów

3. Synteza nowych

nici plazmidu

4. Trawienie enzymem

restrykcyjnym DpnI

5. Transformacja

bakterii E. coli
mieszaniną
reakcyjną

6. Hodowla bakterii na

płytce z podłożem
agarowym
zawierającym
antybiotyk

QuikChange

Mutagenesis

kit

(Stratagene)

Mutageneza
przypadkowa

GeneMorph

Mutagenesis

kit

(Stratagene)

Zastosowanie polimerazy DNA o
zwiększonej właściwości
wprowadzania błędów w
syntetyzowaną nić DNA –
substytucja, czyli zamiana
pojedynczych zasad

Amplifikacja genu
poprzez PCR

Ligacja

Transformacja

Selekcja klonów

Zmutowany gen

Mutageneza
przypadkowa