Wykład 4

Regulacja ekspresji genów

Kontrola ekspresji genów

Specyficzność komórek (Eukaryota)

Geny
aktywne

Geny
nieaktywne

Regulacja ekspresji genów
aktywnych

Kontrola ekspresji genów u Prokaryota

Kontrola ekspresji genów pozwala organizmom

prokariotycznym reagować na zmiany środowiska i produkować

jedynie te białka, które są w danej chwili potrzebne.

Białka produkowane w ilościach zależnych od warunków

środowiska -

fakultatywne, dostosowawcze

. Białka

produkowane w sposób ciągły –

konstytutywne

.

Poziom stężenia danego białka jest wypadkową szybkości

procesu jego produkcji i degradacji. Poziom ten jest regulowany

u bakterii głównie przez kontrolę szybkości wytwarzania białek.

Podstawowe mechanizmy regulacji:

•

zmiana tempa transkrypcji

• zmiana czasu półtrwania mRNA

• zmiana wydajności translacji

Operony

Geny bakterii często zgromadzone są w jednostki

transkrypcyjne nazywane

operonami

. W skład operonu

wchodzą zwykle geny białek powiązanych ze sobą

funkcjonalnie.
W genomach bakterii są również pojedyncze geny

kodujące białka regulujące ekspresję genów w operonach,

Operony indukowane

– zawierają geny białek szlaków

katabolitycznych, ich ekspresja jest indukowana przez

obecność substratu.

Operony hamowane

– zawierają geny enzymów szlaków

biosyntezy, ich ekspresja jest hamowana przez wzrost

stężenia produktu. Produkt może też kontrolować

ekspresję operonów przez

atenuację

.

Galaktoza, glukoza, laktoza

Laktoza – dwusacharyd zbudowany z galaktozy i glukozy.

O

OH

CH

2

OH

OH

OH

OH

O

OH

OH

CH

2

OH

OH

OH

galactose

glucose

O

OH

CH

2

OH

OH

OH

O

OH

CH

2

OH

OH

OH

O

lactose

-

galactosidase

Operon laktozowy E. coli

1

Operon laktozowy (lac) u E. coli zawiera geny trzech białek

niezbędnych dla przyswajania laktozy:
lacZ koduje -galaktozydazę

lacY koduje permeazę -galaktozydazową

lacA koduje transacetylazę -galaktozydazową

Ekspresja tych białek

indukowana

jest przez obecność

allolaktozy.
Region regulatorowy operonu lac zawiera:
lacI – gen kodujący represor operonu lac
CAP – miejsce wiążące białko CAP (catabolite activating protein)
Produktem transkrypcji operonu lac jest policistronowe mRNA

odcinek regulatorowy

promotor-operator

lacI

lacZ

lacY

lacA

p-o

CAP

3’

5’

Represja kataboliczna operonu lac

Represja kataboliczna

pozwala na zablokowanie ekspresji

operonu lac w obecności glukozy.

lacZ

CAP

p-o

lacY

lacA

lacI

CAP

cAMP

polimeraza

mRNA

cAMP

glukoza

cAMP

glukoza

Indukcja lac przez laktozę

Cząsteczki laktozy wiążąc się z represorem operonu
lac zmieniają jego konformację. W tej postaci nie
może się on wiązać z regionem operatora.

lacZ

lacI

p-o

represor

polimeraza

lacY

lacA

lacZ

lacI

p-o

mRNA

allolaktoza

polimeraza

lacY

lacA

ak

ty

w

no

ść

[min]

5

10

15

20

Operon tryptofanowy

Operon tryptofanowy zawiera pięć genów kodujących białka

związane z syntezą tryptofanu. Transkrypcja operonu hamowana

jest przez obecność tryptofanu (działającego jako

korepresor

).

trpC trpB

represor

p-o

trpA

trpD

trpE

atenuator

trpA

trpB

trpC

trpD

atn

rep

p-o

polimeraza

Trp

trpA

trpB

trpC

trpD

atn

rep

p-o

polimeraza

mRNA

a

kt

yw

n

o

ść

[min]

5

10

15

20

Atenuacja operonu trp

1

Transkrypcja początkowej sekwencji (leader

sequence) operonu trp może być zainicjowana

pomimo obecności tryptofanu.

W obecności dużych stężeń tryptofanu synteza

mRNA kodującego ten aminokwas jest przerywana

po utworzeniu nici o długości około 140

nukleotydów.

Tego typu regulacja ekspresji genu nazywana jest

atenuacją

.

Atenuacja operonu trp

2

Atenuacja jest możliwa dzięki obecności odpowiedniej sekwencji

(attenuator site) w początkowym regionie operonu trp.
Atenuacja jest możliwa dzięki współistnieniu transkrypcji i

translacji.

UGGUGG

UGA

UUUUUU

5’

3’

1

2

3

4

1

2

3

4

5’

3’

Atenuacja operonu trp

3

Poprzez różne tempa zachodzenia transkrypcji i translacji w

obecności (lub przy niskim stężeniu) tryptofanu struktura

spinki do włosów tworzona jest albo przez regiony 3 i 4 albo

przez regiony 2 i 3.

2

3

4

5’

3’

1

UGA

translacja

rybosom

“spinka”

stop

[Trp]
wysokie

2

3

4

5’

3’

1

UGA

UGG

opóźnienie rybosomu

rybosom

[Trp] niskie

Atenuacja innych operonów

Regiony atenuacji obecne są także w sekwencjach

operonów odpowiedzialnych za produkcję:

• treoniny

• histydyny

• leucyny

• fenyloalaniny

Ilość kodonów odwołujących się do obecności

aminokwasu, którego produkcja jest regulowana,

jest różna w różnych operonach.

Operon ara

Operon ara – odpowiedzialny za metabolizm arabinozy u E. coli.
To samo białko regulatorowe może indukować lub hamować

ekspresję genów strukturalnych operonu ara.

transkrypcja

arabinoza +

brak transkrypcji

arabinoza -

araC

O

2

O

1

CAP

I

araB araA araD

CAP + cAMP

białko regulatorowe

Regulacja przez czynniki sigma

Podjednostka  polimerazy RNA jest odpowiedzialna za inicjację

transkrypcji.
Zamiana tej podjednostki na alternatywną pozwala polimerazie

rozpoznawać różne promotory i tym samym syntezować różne

zestawy białek.
Tego typu regulacja wykorzystywana jest podczas drastycznych

zmian warunków środowiska (np. szok termiczny).

a

a



’



polimeraza RNA

Poziomy kontroli ekspresji genu

DNA

nhRNA

mRNA

białko

aktywne

nieaktywne

kontrola

transkrypcji i

obróbki RNA

kontrola

transportu

kontrola

translacji

kontrola

aktywności

białka

kontrola

degradacji

kontrola

przemodelowania

chromatyny

Terytoria chromosomów

Nawet w interfazie chromosomy

nie są wymieszane w jądrze ale

zajmują określone obszary (tzw.

terytoria chromosomów

)

oddzielone od siebie domenami

międzychromosomalnymi.
Fragmenty chromosomów

zawierające geny aktywne

transkrypcyjne przesuwane są

na brzegi terytoriów.
Tzw.

fabryki transkrypcyjne

zawierają większość polimeraz

RNA i czynniki transkrypcyjne.

Terytoria
chromosomów 13
uwidocznione przy
pomocy techniki FISH.

Croft et al. (1999) J. Cell Biol.
145: 1119–1131

Modelowanie chromatyny

Transkrypcja genów jest możliwa po

uwolnieniu DNA ze struktury

nukleosomów. Modelowanie

chromatyny odbywa się z udziałem

kompleksów modelujących. Są one

rekrutowane (lub nie) do genów, które

zaznaczone są obecnością czynników

aktywujących (lub wyłączających)

transkrypcję, znajdujących się w

regionie promotorów. Kompleksy

modelujące mogą też być

aktywowane obecnością

zmodyfikowanych histonów lub

metylacją odcinków regulatorowych

DNA.

HDAC

HAT

Pol II

aktywacja transkrypcji

acetylacja histonów

Regulacja ekspresji u Eukaryota

1

Genom człowieka zawiera około 30 000 genów, z czego w

pojedynczej komórce aktywnych jest około 15%.
W komórkach eukariotycznych kontrola aktywności genów

odbywa się głównie poprzez regulację wydajności transkrypcji.
Transkrypcja jest dokonywana przez trzy polimerazy RNA (I, II i

III). Różnią się one budową regionów rozpoznających

sekwencję promotora i wiążących różne czynniki

transkrypcyjne.

wzmacniacz

5’

3’

promotor

gen

struktury

miejsce startu

transkrypcji

700 - 1000 nukleotydów

5’

3’

-30

-70

-110

GGGCGG

kaseta GC

GGCCAATC

kaseta CAAT

TATAAA

kaseta TATA

miejsce startu

transkrypcji

Regulacja ekspresji u Eukaryota

2

Czynniki transkrypcyjne

– białka regulujące ekspresję

genów przez wiązanie z regionem promotora.
Inicjacja transkrypcji wymaga utworzenia

inicjatorowego

kompleksu transkrypcyjnego (TIC)

. Jest

on tworzony przez czynniki transkrypcyjne wiążące

się w regionie kasety TATA.

sekwencja

wzmacniająca

-10 do -50 kpz

sekwencje

regulatorowe

działające

cis

czynniki

transkrypcyjne

działające

trans

TATA

TIC

gen

czynnik

transkrypcyjny

sekwencja

wzmacniająca

+10 do +50 kpz

5’

3’

start transkrypcji

TATA

-25 pz

Pol II

P P P P

transkrypcja

TFIIE

TFIIH

TFIIF

Pol II

Kompleks transkrypcyjny

• podjednostka TFIID (TPZ, TBP) rozpoznaje TATA i

TFIID wiąże się z kasetą TATA

• TFIIB wiąże się z TFIID

• TFIIH i TFIIE wiążą się z DNA

• TFIIF dostarcza Pol II i Pol II wiąże się z DNA

• TFIIH (kinaza białkowa) fosforyluje Pol II

• ufosforylowana polimeraza rozpoczyna transkrypcję

TFIID

TPZ

TFIIB

Promotory polimeraz RNA

Pol I – zlokalizowana w jąderku, synteza rybosomów.
Pol II – zlokalizowana w nukleoplazmie, synteza

hnRNA (prekursora mRNA).
Pol III – zlokalizowana w nukloplazmie, synteza tRNA

i innych małych RNA

5’

3’

TIC

Pol II

promotor

transkrypcja

5’

3’

UFB1

Pol I

proksymalny

element

kontrolny

-180 do - 170 pz

UFB1

transkrypcja

promotor

podstawowy

-45 do +20 pz

SL1

SL1

5’

3’

promotory

wewnętrzne

TFIIIC

TFIIIC

transkrypcja

promotor

TFIIIA

TFIIIB

Pol III

Aktywacja genu na odległość

Sekwencja wzmacniacza może byś zlokalizowana proksymalnie

lub dystalnie na tej samej nici DNA (aktywacja cis), możliwa

jest też lokalizacja na innej nici (aktywacja trans).

5’

3’

promotor

miejsce startu transkrypcji

wzmacniacz

5’

3’

transkrypcja

białko

aktywatora

czynnik

transkrypcyjny

Sekwencje regulacyjne DNA

Sekwencje regulacyjne DNA oddziałują z cząsteczkami

białka w celu uzyskania właściwej funkcji kontrolnej.
Typy sekwencji regulacyjnych:
• określające początek translacji
• określające zakończenie lub zatrzymanie translacji
• regulujące aktywność genu (represory, aktywatory,

wzmacniacze).

Białka regulatorowe (czynniki transkrypcyjne) wiążą się z

DNA w obrębie rowka dużego. Bardzo często białka te

zawierają domeny wiążące DNA o specyficznej budowie:
• helisa-zwrot-helisa
• palce cynkowe
• zamki leucynowe (odpowiedzialne za dimeryzację białek)

Motywy białek wiążące DNA

Zn

H

H - histydyna C - cysteina

H

H

H

C

C

C

C

Zn

Leu
Leu

a

-helisa

Leu
Leu

Leu
Leu

domena zasadowa

Leu
Leu

helisa

helisa

pętla (zwrot

)

Regulacja epigenetyczna

Epigenetyka

: zmiany w ekspresji genów, które są

przekazywane do komórek potomnych bez zmian w

sekwencji DNA.
Regulacja epigenetyczna pomaga w zachowaniu

indywidualnych cech komórek (tzw. pamięć komórkowa).

Wszystkie myszy mają ten sam allel genu kodującego kolor
futra (A

vy

).

Metylacja DNA

1

Metylacja cytozyny zachodzi dzięki działaniu

DNMT – metylotransferazy DNA.

N

N

O

NH

2

H

CH

3

N

N

O

NH

2

H

Metylacja DNA

2

•

3-4% wszystkich cytozyn genomu ulega metylacji

•

5-metylocytozyna stanowi 0,75-1% zasad u ssaków

•

70-80% wszystkich sekwencji CpG jest zmetylowanych

•

Metylacji ulegają głównie pojedyncze CpG

•

W obrębie tzw.

wysp CpG

stopień metylacji jest dużo

mniejszy

•

Dinukleotydy CpG występują w genomie rzadziej niż

pozostałe dinukleotydy (ok. 20% teoretycznej

wartości).

•

Wyspy CpG to obszary DNA (ok. 1 kpz) o zwiększonej

ilości CpG.

•

Usytuowane są głównie w pobliżu końców 5’ genów (w

promotorach i pierwszych eksonach).

•

Genom człowieka zawiera ok. 29 000 wysp CpG.

•

Geny aktywne transkrypcyjnie wykazują hipometylację.

Metylacja DNA

3

Metylacja reszt cytozynowych ma duże znaczenie dla

regulacji genu.

Metylacja zachowawcza

: dodawanie grup metylowych

do nowo powstałych w procesie replikacji nici DNA.

Metylacja DNA de novo

: grupy metylowe dodawane są

w nowych pozycjach na obu niciach DNA.

5’

3’

CG

CG

CG

CH

3

CH

3

CH

3

5’

3’

GC

GC

GC

CH

3

CH

3

CH

3

5’

3’

CG

CG

CG

CH

3

CH

3

CH

3

5’

3’

GC

GC

GC

CH

3

CH

3

CH

3

5’

3’

GC

GC

GC

CH

3

CH

3

CH

3

5’

3’

CG

CG

CG

CH

3

CH

3

CH

3

5’

3’

CG

CG

CG

5’

3’

GC

GC

GC

5’

3’

CG

CG

CG

CH

3

CH

3

5’

3’

GC

GC

GC

CH

3

CH

3

Hormony i cytokiny

Hormony

: małe cząsteczki (steroidy lub

polipeptydy) produkowane przez pewne typy

komórek.
Hormony steroidowe przenikają do cytoplazmy,

łączą się receptorami i aktywują wzmacniacze. W

ten sposób aktywują transkrypcję

poszczególnych genów.

Cytokiny

: białka działające podobnie jak hormony

polipeptydowe. Wiążą się z receptorami na

powierzchni komórki, uruchamiają kaskadę

transdukcji sygnału. Aktywacja białek szlaku

transdukcji odbywa się głównie przez

fosforylację.

Inhibitory transkrypcji i translacji

Antybiotyki (działanie u Prokaryota):
• aktynomycyna – interkalacja pomiędzy sąsiadującymi parami

G-C

• erytromycyna, streptomycyna – wiąże się do cząsteczki 50S i

wstrzymuje syntezę rybosomu 70S

• neomycyna – wiąże się do podjednostki 30S i inhibuje

wiązanie tRNA

• tetracyklina – inhibuje wiązanie tRNA do podjednostki 30S

rybosomu

(działanie u Eukaryota):
 a-amanityna – inhibuje polimerazę II
 chloramfenikol – inhibuje peptydylotransferazę rybosomów

mitochondrialnych

 cykloheksymid – inhibuje peptydylotransferazę
 toksyna błonicy – inhibuje inicjację czynnika 2 i translokację