Wykład 4
Regulacja ekspresji genów
Wykład 4
Regulacja ekspresji genów
Kontrola ekspresji genów
Specyficzność komórek (Eukaryota)
Geny
aktywne
Geny
nieaktywne
Regulacja ekspresji genów
aktywnych
Kontrola ekspresji genów u Prokaryota
Kontrola ekspresji genów pozwala organizmom
prokariotycznym reagować na zmiany środowiska i produkować
jedynie te białka, które są w danej chwili potrzebne.
Białka produkowane w ilościach zależnych od warunków
środowiska -
fakultatywne, dostosowawcze
. Białka
produkowane w sposób ciągły –
konstytutywne
.
Poziom stężenia danego białka jest wypadkową szybkości
procesu jego produkcji i degradacji. Poziom ten jest regulowany
u bakterii głównie przez kontrolę szybkości wytwarzania białek.
Podstawowe mechanizmy regulacji:
•
zmiana tempa transkrypcji
• zmiana czasu półtrwania mRNA
• zmiana wydajności translacji
Operony
Geny bakterii często zgromadzone są w jednostki
transkrypcyjne nazywane
operonami
. W skład operonu
wchodzą zwykle geny białek powiązanych ze sobą
funkcjonalnie.
W genomach bakterii są również pojedyncze geny
kodujące białka regulujące ekspresję genów w operonach,
Operony indukowane
– zawierają geny białek szlaków
katabolitycznych, ich ekspresja jest indukowana przez
obecność substratu.
Operony hamowane
– zawierają geny enzymów szlaków
biosyntezy, ich ekspresja jest hamowana przez wzrost
stężenia produktu. Produkt może też kontrolować
ekspresję operonów przez
atenuację
.
Galaktoza, glukoza, laktoza
Laktoza – dwusacharyd zbudowany z galaktozy i glukozy.
O
OH
CH
2
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
CH
2
OH
OH
OH
galactose
glucose
O
OH
CH
2
OH
OH
OH
O
OH
CH
2
OH
OH
OH
O
lactose
-
galactosidase
Operon laktozowy E. coli
1
Operon laktozowy (lac) u E. coli zawiera geny trzech białek
niezbędnych dla przyswajania laktozy:
lacZ koduje -galaktozydazę
lacY koduje permeazę -galaktozydazową
lacA koduje transacetylazę -galaktozydazową
Ekspresja tych białek
indukowana
jest przez obecność
allolaktozy.
Region regulatorowy operonu lac zawiera:
lacI – gen kodujący represor operonu lac
CAP – miejsce wiążące białko CAP (catabolite activating protein)
Produktem transkrypcji operonu lac jest policistronowe mRNA
odcinek regulatorowy
promotor-operator
lacI
lacZ
lacY
lacA
p-o
CAP
3’
5’
Represja kataboliczna operonu lac
Represja kataboliczna
pozwala na zablokowanie ekspresji
operonu lac w obecności glukozy.
lacZ
CAP
p-o
lacY
lacA
lacI
CAP
cAMP
polimeraza
mRNA
cAMP
glukoza
cAMP
glukoza
Indukcja lac przez laktozę
Cząsteczki laktozy wiążąc się z represorem operonu
lac zmieniają jego konformację. W tej postaci nie
może się on wiązać z regionem operatora.
lacZ
lacI
p-o
represor
polimeraza
lacY
lacA
lacZ
lacI
p-o
mRNA
allolaktoza
polimeraza
lacY
lacA
ak
ty
w
no
ść
[min]
5
10
15
20
Operon tryptofanowy
Operon tryptofanowy zawiera pięć genów kodujących białka
związane z syntezą tryptofanu. Transkrypcja operonu hamowana
jest przez obecność tryptofanu (działającego jako
korepresor
).
trpC trpB
represor
p-o
trpA
trpD
trpE
atenuator
trpA
trpB
trpC
trpD
atn
rep
p-o
polimeraza
Trp
trpA
trpB
trpC
trpD
atn
rep
p-o
polimeraza
mRNA
a
kt
yw
n
o
ść
[min]
5
10
15
20
Atenuacja operonu trp
1
Transkrypcja początkowej sekwencji (leader
sequence) operonu trp może być zainicjowana
pomimo obecności tryptofanu.
W obecności dużych stężeń tryptofanu synteza
mRNA kodującego ten aminokwas jest przerywana
po utworzeniu nici o długości około 140
nukleotydów.
Tego typu regulacja ekspresji genu nazywana jest
atenuacją
.
Atenuacja operonu trp
2
Atenuacja jest możliwa dzięki obecności odpowiedniej sekwencji
(attenuator site) w początkowym regionie operonu trp.
Atenuacja jest możliwa dzięki współistnieniu transkrypcji i
translacji.
UGGUGG
UGA
UUUUUU
5’
3’
1
2
3
4
1
2
3
4
5’
3’
Atenuacja operonu trp
3
Poprzez różne tempa zachodzenia transkrypcji i translacji w
obecności (lub przy niskim stężeniu) tryptofanu struktura
spinki do włosów tworzona jest albo przez regiony 3 i 4 albo
przez regiony 2 i 3.
2
3
4
5’
3’
1
UGA
translacja
rybosom
“spinka”
stop
[Trp]
wysokie
2
3
4
5’
3’
1
UGA
UGG
opóźnienie rybosomu
rybosom
[Trp] niskie
Atenuacja innych operonów
Regiony atenuacji obecne są także w sekwencjach
operonów odpowiedzialnych za produkcję:
• treoniny
• histydyny
• leucyny
• fenyloalaniny
Ilość kodonów odwołujących się do obecności
aminokwasu, którego produkcja jest regulowana,
jest różna w różnych operonach.
Operon ara
Operon ara – odpowiedzialny za metabolizm arabinozy u E. coli.
To samo białko regulatorowe może indukować lub hamować
ekspresję genów strukturalnych operonu ara.
transkrypcja
arabinoza +
brak transkrypcji
arabinoza -
araC
O
2
O
1
CAP
I
araB araA araD
CAP + cAMP
białko regulatorowe
Regulacja przez czynniki sigma
Podjednostka polimerazy RNA jest odpowiedzialna za inicjację
transkrypcji.
Zamiana tej podjednostki na alternatywną pozwala polimerazie
rozpoznawać różne promotory i tym samym syntezować różne
zestawy białek.
Tego typu regulacja wykorzystywana jest podczas drastycznych
zmian warunków środowiska (np. szok termiczny).
a
a
’
polimeraza RNA
Poziomy kontroli ekspresji genu
DNA
nhRNA
mRNA
białko
aktywne
nieaktywne
kontrola
transkrypcji i
obróbki RNA
kontrola
transportu
kontrola
translacji
kontrola
aktywności
białka
kontrola
degradacji
kontrola
przemodelowania
chromatyny
Terytoria chromosomów
Nawet w interfazie chromosomy
nie są wymieszane w jądrze ale
zajmują określone obszary (tzw.
terytoria chromosomów
)
oddzielone od siebie domenami
międzychromosomalnymi.
Fragmenty chromosomów
zawierające geny aktywne
transkrypcyjne przesuwane są
na brzegi terytoriów.
Tzw.
fabryki transkrypcyjne
zawierają większość polimeraz
RNA i czynniki transkrypcyjne.
Terytoria
chromosomów 13
uwidocznione przy
pomocy techniki FISH.
Croft et al. (1999) J. Cell Biol.
145: 1119–1131
Modelowanie chromatyny
Transkrypcja genów jest możliwa po
uwolnieniu DNA ze struktury
nukleosomów. Modelowanie
chromatyny odbywa się z udziałem
kompleksów modelujących. Są one
rekrutowane (lub nie) do genów, które
zaznaczone są obecnością czynników
aktywujących (lub wyłączających)
transkrypcję, znajdujących się w
regionie promotorów. Kompleksy
modelujące mogą też być
aktywowane obecnością
zmodyfikowanych histonów lub
metylacją odcinków regulatorowych
DNA.
HDAC
HAT
Pol II
aktywacja transkrypcji
acetylacja histonów
Regulacja ekspresji u Eukaryota
1
Genom człowieka zawiera około 30 000 genów, z czego w
pojedynczej komórce aktywnych jest około 15%.
W komórkach eukariotycznych kontrola aktywności genów
odbywa się głównie poprzez regulację wydajności transkrypcji.
Transkrypcja jest dokonywana przez trzy polimerazy RNA (I, II i
III). Różnią się one budową regionów rozpoznających
sekwencję promotora i wiążących różne czynniki
transkrypcyjne.
wzmacniacz
5’
3’
promotor
gen
struktury
miejsce startu
transkrypcji
700 - 1000 nukleotydów
5’
3’
-30
-70
-110
GGGCGG
kaseta GC
GGCCAATC
kaseta CAAT
TATAAA
kaseta TATA
miejsce startu
transkrypcji
Regulacja ekspresji u Eukaryota
2
Czynniki transkrypcyjne
– białka regulujące ekspresję
genów przez wiązanie z regionem promotora.
Inicjacja transkrypcji wymaga utworzenia
inicjatorowego
kompleksu transkrypcyjnego (TIC)
. Jest
on tworzony przez czynniki transkrypcyjne wiążące
się w regionie kasety TATA.
sekwencja
wzmacniająca
-10 do -50 kpz
sekwencje
regulatorowe
działające
cis
czynniki
transkrypcyjne
działające
trans
TATA
TIC
gen
czynnik
transkrypcyjny
sekwencja
wzmacniająca
+10 do +50 kpz
5’
3’
start transkrypcji
TATA
-25 pz
Pol II
P P P P
transkrypcja
TFIIE
TFIIH
TFIIF
Pol II
Kompleks transkrypcyjny
• podjednostka TFIID (TPZ, TBP) rozpoznaje TATA i
TFIID wiąże się z kasetą TATA
• TFIIB wiąże się z TFIID
• TFIIH i TFIIE wiążą się z DNA
• TFIIF dostarcza Pol II i Pol II wiąże się z DNA
• TFIIH (kinaza białkowa) fosforyluje Pol II
• ufosforylowana polimeraza rozpoczyna transkrypcję
TFIID
TPZ
TFIIB
Promotory polimeraz RNA
Pol I – zlokalizowana w jąderku, synteza rybosomów.
Pol II – zlokalizowana w nukleoplazmie, synteza
hnRNA (prekursora mRNA).
Pol III – zlokalizowana w nukloplazmie, synteza tRNA
i innych małych RNA
5’
3’
TIC
Pol II
promotor
transkrypcja
5’
3’
UFB1
Pol I
proksymalny
element
kontrolny
-180 do - 170 pz
UFB1
transkrypcja
promotor
podstawowy
-45 do +20 pz
SL1
SL1
5’
3’
promotory
wewnętrzne
TFIIIC
TFIIIC
transkrypcja
promotor
TFIIIA
TFIIIB
Pol III
Aktywacja genu na odległość
Sekwencja wzmacniacza może byś zlokalizowana proksymalnie
lub dystalnie na tej samej nici DNA (aktywacja cis), możliwa
jest też lokalizacja na innej nici (aktywacja trans).
5’
3’
promotor
miejsce startu transkrypcji
wzmacniacz
5’
3’
transkrypcja
białko
aktywatora
czynnik
transkrypcyjny
Sekwencje regulacyjne DNA
Sekwencje regulacyjne DNA oddziałują z cząsteczkami
białka w celu uzyskania właściwej funkcji kontrolnej.
Typy sekwencji regulacyjnych:
• określające początek translacji
• określające zakończenie lub zatrzymanie translacji
• regulujące aktywność genu (represory, aktywatory,
wzmacniacze).
Białka regulatorowe (czynniki transkrypcyjne) wiążą się z
DNA w obrębie rowka dużego. Bardzo często białka te
zawierają domeny wiążące DNA o specyficznej budowie:
• helisa-zwrot-helisa
• palce cynkowe
• zamki leucynowe (odpowiedzialne za dimeryzację białek)
Motywy białek wiążące DNA
Zn
H
H - histydyna C - cysteina
H
H
H
C
C
C
C
Zn
Leu
Leu
a
-helisa
Leu
Leu
Leu
Leu
domena zasadowa
Leu
Leu
helisa
helisa
pętla (zwrot
)
Regulacja epigenetyczna
Epigenetyka
: zmiany w ekspresji genów, które są
przekazywane do komórek potomnych bez zmian w
sekwencji DNA.
Regulacja epigenetyczna pomaga w zachowaniu
indywidualnych cech komórek (tzw. pamięć komórkowa).
Wszystkie myszy mają ten sam allel genu kodującego kolor
futra (A
vy
).
Metylacja DNA
1
Metylacja cytozyny zachodzi dzięki działaniu
DNMT – metylotransferazy DNA.
N
N
O
NH
2
H
CH
3
N
N
O
NH
2
H
Metylacja DNA
2
•
3-4% wszystkich cytozyn genomu ulega metylacji
•
5-metylocytozyna stanowi 0,75-1% zasad u ssaków
•
70-80% wszystkich sekwencji CpG jest zmetylowanych
•
Metylacji ulegają głównie pojedyncze CpG
•
W obrębie tzw.
wysp CpG
stopień metylacji jest dużo
mniejszy
•
Dinukleotydy CpG występują w genomie rzadziej niż
pozostałe dinukleotydy (ok. 20% teoretycznej
wartości).
•
Wyspy CpG to obszary DNA (ok. 1 kpz) o zwiększonej
ilości CpG.
•
Usytuowane są głównie w pobliżu końców 5’ genów (w
promotorach i pierwszych eksonach).
•
Genom człowieka zawiera ok. 29 000 wysp CpG.
•
Geny aktywne transkrypcyjnie wykazują hipometylację.
Metylacja DNA
3
Metylacja reszt cytozynowych ma duże znaczenie dla
regulacji genu.
Metylacja zachowawcza
: dodawanie grup metylowych
do nowo powstałych w procesie replikacji nici DNA.
Metylacja DNA de novo
: grupy metylowe dodawane są
w nowych pozycjach na obu niciach DNA.
5’
3’
CG
CG
CG
CH
3
CH
3
CH
3
5’
3’
GC
GC
GC
CH
3
CH
3
CH
3
5’
3’
CG
CG
CG
CH
3
CH
3
CH
3
5’
3’
GC
GC
GC
CH
3
CH
3
CH
3
5’
3’
GC
GC
GC
CH
3
CH
3
CH
3
5’
3’
CG
CG
CG
CH
3
CH
3
CH
3
5’
3’
CG
CG
CG
5’
3’
GC
GC
GC
5’
3’
CG
CG
CG
CH
3
CH
3
5’
3’
GC
GC
GC
CH
3
CH
3
Hormony i cytokiny
Hormony
: małe cząsteczki (steroidy lub
polipeptydy) produkowane przez pewne typy
komórek.
Hormony steroidowe przenikają do cytoplazmy,
łączą się receptorami i aktywują wzmacniacze. W
ten sposób aktywują transkrypcję
poszczególnych genów.
Cytokiny
: białka działające podobnie jak hormony
polipeptydowe. Wiążą się z receptorami na
powierzchni komórki, uruchamiają kaskadę
transdukcji sygnału. Aktywacja białek szlaku
transdukcji odbywa się głównie przez
fosforylację.
Inhibitory transkrypcji i translacji
Antybiotyki (działanie u Prokaryota):
• aktynomycyna – interkalacja pomiędzy sąsiadującymi parami
G-C
• erytromycyna, streptomycyna – wiąże się do cząsteczki 50S i
wstrzymuje syntezę rybosomu 70S
• neomycyna – wiąże się do podjednostki 30S i inhibuje
wiązanie tRNA
• tetracyklina – inhibuje wiązanie tRNA do podjednostki 30S
rybosomu
(działanie u Eukaryota):
a-amanityna – inhibuje polimerazę II
chloramfenikol – inhibuje peptydylotransferazę rybosomów
mitochondrialnych
cykloheksymid – inhibuje peptydylotransferazę
toksyna błonicy – inhibuje inicjację czynnika 2 i translokację