Wykład 2

Replikacja DNA

Replikacja DNA

1

Replikacja:

kopiowanie (podwojenie)

własnego DNA przez komórkę.

Replikacja jest konieczna dla

przekazania informacji komórkom

potomnym.

Zachodzi w

fazie S cyklu

komórkowego.

Replikacja DNA

2

Replikacja DNA ma charakter

semikonserwatywny

: jedna nić nowego DNA

pochodzi z DNA wyjściowego, druga jest nowa.

Teoretycznie możliwa jest

również replikacja

konserwatywna

i

dyspersywna.

Badania prowadzone u

Prokaryota przez Meselsona

i Stahla (1958) wykluczyły

takie możliwości.

Eksperyment Meselsona i Stahla

E. coli hodowane w

medium znakowanym 15N

Pokolenie 0

E. coli znakowane N15

dodane do medium

znakowanego 14N

Pokolenie 1

Pokolenie 2

Pokolenie 3

Ekstrakcja DNA i

wirowanie w gradiencie

15N/15N

15N/14N

15N/14N

15N/14N

14N/14N

14N/14N

Replikacja DNA

2

Etapy replikacji:
• rozwarcie struktury podwójnej

helisy
• dobudowanie

komplementarnych zasad

(nukleotydów) i utworzenie dwu

nowych nici (wiodącej i

opóźnionej)
• splecenie nowych i starych nici

Miejsca inicjacji replikacji

Replikacja rozpoczyna się w specyficznych

miejscach inicjacji nazywanych

ori

(

ang. origin).

U Prokaryota występuje jedno takie miejsce u

Eukaryota jest ich wiele.

Miejsca inicjacji replikacji są bogate w pary

A-T

. Są

one związane dwoma wiązaniami wodorowymi, co

ułatwia ich rozdzielnie (w porównaniu do par C-G).

Miejsca inicjacji rozpoznawane są przez białka

inicjujące replikację.

Inicjacja replikacji E. coli

Replikacja zaczyna się od rozpoznania przez białko

DnaA

miejsca inicjacji replikacji (Ori C u E. coli).

W chromosomie bakterii E. coli jest jedno miejsce Ori C.
Agregat 30-40 cząsteczek białka DnaA przyłącza się do
sekwencji 9-nukleotydowych, DNA owija się wokół
kompleksu białka Dna A.

Ori C (245 pz)

3 x GATCTNTTNTT TT

4 x TTATNCANA

Kontynuacja replikacji E. coli

Silne naprężenia DNA
powodują rozrywanie
wiązań wodorowych w
obrębie powtórzeń 13-
nukleotydowych.

Kolejne przyłączane
białka to:

DnaB

(helikaza) – w

kompleksie z białkiem
DnaC (tworzą
heksamery)

Prymaza

– synteza

starterów RNA

Widełki replikacyjne

Replikacja może zachodzić w sposób ciągły jedynie dla

nici

wiodącej

(o orientacji 5’ – 3’). W

nici opóźnionej

(3’ – 5’) nowa

nić DNA syntetyzowana jest w odcinkach (fragmenty Okazaki).

Zarówno w organizmach prokariotycznych jak i w eukariotycznych
replikacja odbywa się w obrębie

widełek replikacyjnych

.

Replisom

– zespół białek biorących udział w procesie replikacji DNA.

W skład replisomu wchodzą:

•

Gyraza

(topoizomeraza) – przecina chwilowo jedną (I DNA

topoizomeraza) lub dwie (II DNA topoizomeraza) nici DNA

umożliwiając swobodną rotację („problem zwinięcia”)

•

Helikaza

– rozrywa wiąz. H i rozwijaja podwójną helisę DNA.

•

Prymaza

– dokonujesyntezy primerów, co pozwala na syntezę

fragmentów Okazaki.

•

Polimerazy DNA

– dokonują syntezy nowych nici DNA,

sprawdzają poprawność procesu, dokonują korekty, uzupełniają luki

po starterach.

•

Ligaza

– łączy fragmenty Okazaki na nici opóźnionej

•

Białka wiążące pojedynczą nić

(

SSB

- ang. Single Strand

Binding proteins) – wiążą się z rozplecionymi nićmi DNA, stabilizuję

je i zapobiegają tworzeniu struktury spinki do włosów.

Replisom

Replikacja u Prokaryota

Replikacja u Prokaryota zaczyna się w jednym miejscu

DNA.
W komórkach E. coli szybkość replikacji wynosi około

1000 pz/s.

Wielkość fragmentów Okazaki u Prokaryota wynosi

1000-2000 nuklotydów.

Nowy DNA syntetyzowany jest zawsze

w kierunku od 5’ do 3’.

Replikacja u Eucaryota

Replikacja u Eukaryota zaczyna

się w wielu miejscach DNA.
Powstałe

replikony

rozszerzają

się, łączą i powstają kopie DNA.
Wielkość fragmentów Okazaki u

Eukaryota waha się w

granicach 100-200

nukleotydów.
Szybkość replikacji wynosi

około 100 pz/s.
Dzieje się tak ze względu na

powolność procesu rozplatania

nukleosomów.

12

Korekta poprawności replikacji

Kontrola poprawności kolejności wprowadzonych

nukleotydów odbywa się podczas replikacji.
Polimerazy DNA (np. Pol I) posiadają aktywność

egzonukleazową (3’-5’), która umożliwia im usuwanie

nieprawidłowo wprowadzonych nukleotydów i

zastępowanie ich prawidłowymi.

Egzonukleaza

– enzym posiadający zdolność do hydrolizy

wiązania fosfodiestrowego na końcu 3’ lub 5’ łańcucha

DNA.

Endonukleaza

– enzym posiadający zdolność do hydrolizy

wiązania fosfodiestrowego wewnątrz łańcucha DNA.

Szacuje się, że 1:5 000 000 wprowadzanych nukleotydów

jest nieprawidłowy (10

9

).

Schemat działania polimerazy

P

P

T

A

G

C

T

A

G

C

G

C

G

G

A

C P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

T

P

P

P

5’

3’

5’

3’

polimeraza DNA

nukleotyd

P

P

T

A

G

C

T

A

G

C

G

C

G

G

A

C P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

5’

3’

5’

3’

T

P

P

P

wydłużenie

P

P

T

A

G

C

T

A

G

C

G

C

G

G

A

C P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

5’

3’

5’

T

P

P

P

3’

P

P

T

A

G

C

T

A

G

C

G

C

G

G

A

C P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

5’

3’

5’

T

P

3’

P

A

P

P

P

G

P

G

P

P

T

A

G

C

T

A

G

C

G

C

G

G

A

C P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

5’

3’

5’

T

P

P

P

3’

P

P

P

A

błąd wydłużenia

korekta

wydłużenie

Polimeraza DNA I E. coli

Polimeraza DNA I

– kodowana jest przez gen

polA, katalizuje reakcję przyłączenia 5’-

trójfosforanów (dATP, dGTP, dCTP, dTTP,) do

grupy 3’-OH tworzącego się łańcucha DNA.
Odgrywa ona istotną rolę w procesie

naprawy DNA i degradacji kwasów

nukleinowych.
Łańcuch polimerazy DNA I (103 kD) może być

przecięty przez proteazę na dwa fragmenty:

68

kDa

i

35 kDa

.

Fragment

68 kDa

oprócz aktywności polimerazy

działa również jako 3’-5’ egzonukleaza (kontrola

poprawności wbudowania nukleotydów).

35 kDa

35 kDa

5’

3’

5’

3’

3’

5’

3’

5’

przemieszczenie pęknięcia

(

)

nick translation

Fragment

35 kDa

przecina wiązania oddalone o kilka nukleotydów od

końca 5’ (usuwa startery RNA i uzupełnia przerwy po usunięciu

startera).

Usuwa też dimery pirymidynowe powstające na skutek działania UV.

Przemieszczenie luki katalizowane przez 35 kDa fragment.

Polimeraza DNA III E. coli

Polimeraza DNA III składa się z wielu podjednostek (900 kDa).
Posiada strukturę asymetrycznego dimeru, jednocześnie replikuje
dwie nici DNA.
W rdzeniu () podjednostka ma aktywność polimerazy,  to

egzonukleaza 3’-5’. Podjednostki  odpowiedzialne są za dimeryzację.











 







’













Działanie polimerazy DNA III

Nić opóźniona DNA jest zapętlona, co pozwala
polimerazie III DNA prowadzić replikację
jednocześnie na obu niciach.

3’
5’

5’

3’

Polimeraza I II DNA

Nić opóźniona

Nić wiodąca

5’

Polimerazy DNA - porównanie

Polimeraza I Polimeraza II

Polimeraza III

Wielkość (kDa)

103

90

rdzeń,(130,27, 5, 10)

Gen

polA

polB

polC

Ilość/komórkę

400

-

10-20

Polimeraza 5’-3’

+

+

+

Egzonukleaza

3’-5’

+

+

+

Egzonukleaza

5’-3’

+

-

-











Lokalizacja

jądro

jądro

jądro

jądro

mitochondri

a

Funkcja
podstawow

a

synteza

starterów

synteza

DNA

naprawa

DNA

naprawa

DNA

replikacja

Inne

funkcje

-

egzonuklea

za 3’-5’

egzonuklea

za 3’-5’

egzonuklea

za 3’-5’

Topoizomerazy DNA

CH

CH

OH

(-)

(-)

(-)

(+)

• Topoizomeraza I

u E. coli relaksuje ujemne

superskręty kolistej cząsteczki DNA.

T. I

łączy się z DNA za pośrednictwem tyrozyny

i przecina jedną nić.

• Topoizomeraza II

relaksuje ujemne i

dodatnie superskręty DNA.

T. II

łączy się z dwoma nićmi i przecina obie.

Przekształca superskręty dodatnie na ujemne.

T. II

pozwala również na rozdzielenie nici

potomnych po replikacji.

Wysoka wierność replikacji – jeden błąd na około

10

9

replikowanych pz.

Błędy mogą się pojawiać częściej ze względu na obecność
tautomerycznych

(iminowych

bądź

enolowych)

form

zasad

purynowych i pirymidynowych (jedna na 10

4

– 10

5

pz).

Mechanizm korekcji jest konieczny by utrzymać wysoką wierność

replikacji.

N

C

N

C

C

C

O

N

H

H

H

H

H

C
C N

C

N

N

C

N

C

H

O

N

H

H

H

H

cytozyn
a

guanina

N

C

N

C

C

C

O

N

H

H

H

H

H

C
C N

C

N

N

C

N

C

N

H

H

H

H

H

imino cytozyna (forma
tautomeryczna)

adenin
a

Mutacje, tautomeria

1

21

Mutacje, tautomeria

2

Terminacja replikacji DNA

1

Zatrzymanie replikacji u Procaryota odbywa się po napotkaniu

przez helikazę DNA

rejonu terminacji

(350 pz).

W chromosomie E. coli występuje sześć regionów terminacji:

TerA, TerD, TerE (aktywne w jednej orientacji) i TerB, TerC, TerF

(aktywne w orientacji przeciwnej).
Sekwencje Ter mają długość 23 pz.
W procesie terminacji uczestniczy tez

białko Tus

. Jest ono

inhibitorem helikazy DNA.

TerA

TerD

TerE

TerC

TerB

TerF

Obszar, w którym następuje

terminacja jest szczególnie

podatny na występowanie delecji.

U Eucaryota nie występują regiony

terminacji.

Replikacja kończy się w momencie

spotkania sąsiednich oczek replikacyjnych

oraz po osiągnięciu rejonów telomerów.

Terminacja replikacji DNA

2

Koniec replikacji kolistego DNA to dwa identyczne koła.
Problem pojawia się przy zakończeniu replikacji liniowych
chromosomów organizmów eukariotycznych.

Na ostatnim
fragmencie nici
opóźniającej się nie
można utworzyć
startera RNA i dlatego
ta nić jest krótsza po
replikacji.