Struktura i funkcje

jądra komórkowego i jąderka

Strukturalne uwarunkowania procesów

zachodzących w jądrze komórkowym

Hipotezy dotyczące ewolucji jądra i błony jądrowej

Składniki jądra komórkowego - DNA

cechy chemiczne
i morfologiczne

lokalizacja/funkcja

satelitarny

- wysoki stopień kondensacji
- tandemowy układ krótkich,
powtarzających się sekwencji

heterochromatyna

nie podlega
transkrypcji

rodzaj

umiarkowanie
powtarzalny

- rozmaity stopień kondensacji
- rozmaita długość sekwencji

odcinki pomiędzy
sekwencjami unikalnymi,
przerywniki
Regulacja aktywności genów

rDNA

- nieznaczny stopień kondensacji
- znaczna powtarzalność sekwencji

przewężenia wtórne
chromosomów,
czasami kariolimfa
ulega transkrypcji na pre-rybosomy,
nie podlega translacji

inne DNA

- nieznaczny stopień kondensacji,
(luźne fibryle chromatynowe)
lub okresowo skondensowane

- unikalne sekwencje nukleotydów

euchromatyna

ulega transkrypcji,
niektóre rodzaje RNA (mRNA)
podlegają translacji

wielkość

genomu

% repetytywnego

DNA

muszka owocowa

organizm

Powtarzające się (repetytywne) DNA

% kodujących

sekwencji DNA

nicień C. elegans

pies domowy

100 MB

175 MB

2.4 GB

mysz

2.5 GB

człowiek

2.9 GB

16.5

14.0

<10

33.7 - ~57

31

1.45

40

1.40

>50

1.20

ryż

466 MB

42

11.8

kukurydza

2.5 GB

77

1

hipoteza „informatyczna”

DNA służy do przechowywania informacji:

pamięć stała – sekwencje kodujące DNA, informacja stabilna i przekazywana kolejnym
pokoleniom komórek
pamięć średnio-terminowa – za pomocą trwałych kompleksów z RNA i białkami oraz modyfikacji
chemicznych DNA (metylacja, acetylacja), może być przekazywana potomnym komórkowm
pamięć krótko-terminowa – dynamicznie powstające kompleksy z RNA i białkami, regulowane
w czasie cyklu komórkowego i w odpowiedzi na warunki środowiska, informacja nie jest
przekazywana komórkom potomnym

wielkość

genomu

ilość genów

muszka owocowa

organizm

nicień C. elegans

100 MB

175 MB

mysz

2.5 GB

człowiek

2.9 GB

18 424

13 601

30 000

25-35 000

u człowieka:
ok. 25 tys. genów
100-200 tys. rodzajów m-RNA
1-3 mln różnych białek

tylko

ok. 2% transkryptów cRNA koduje białka
98% transkryptów ncRNA powstaje na podstawie
tzw. strukturalnego DNA (niekodujące sekwencje)

im bardziej skomplikowany organizm tym większa ilość strukturalnego DNA
dlaczego?

Składniki jądra komórkowego - białka

zawartość [%]

masa cząsteczkowa

[kDa]

klasy histonów

argininy

lizyny

H1

1.8

26.8

19.5-21

H2A

6.4

16.0

14.5

H2B

9.3

10.8

13.8

H3

13.3

9.6

15.3

H4

13.7

9.8

13.0

białka histonowe

post-translacyjne modyfikacje białek histonowych

kod histonowy – wzór modyfikacji post-translacyjnych obecnych w białkach histonowych

fosforylacja
acetylacja
metylacja
ubikwitynacja

Reszty cytozyny w DNA mogą być metylowane

Składniki kodu epigenetycznego

Zmiany w metylacji cytozyn i modyfikacje histonów

reguluje profil ekspresji genów

białka niehistonowe

enzymatyczne

polimerazy DNA, RNA, poli-A
terminalne nukleotydylotransferazy
ligazy, N-glikozydazy
kinazy polinukleotydowe
topoizomerazy I, II ( i )

regulatorowe

proteazy, kinazy, fosfatazy
metylotransferazy/demetylazy
acetylotransferazy/deacetylazy
syntaza poli(ADP)rybozy
glikohydrolaza poli(ADP)rybozylowa

strukturalne

białka HMG (ang. high mobility group)

niektóre białka enzymatyczne i regulatorowe

Składniki jądra komórkowego - białka

Struktura DNA

Poziomy organizacji chromatyny

Poziomy organizacji chromatyny w jądrze komórkowym

Struktura typowego chromosomu metafazalnego

Struktura chromosomu

30 nm filamenty

60000 pętli, każda 5-150 kpz

(średnio 60 kpz)

ok. 1000-3000 miejsc replikacji

Poziomy organizacji DNA w jądrze

helisa DNA

pętla DNA

nukleosom

„chmura”

chromatyny

„obszar”

chromosomalny

1 m

Organizacja DNA w jądrze

Organizacja strukturalna por jądrowych

Schemat transportu przez pory jądrowe

Siatka lamin

Struktura błony jądrowej rozpada się i odtwarza się

Struktura jąderka

Struktura jąderka zmienia się w czasie

cyklu komórkowego

Modele struktury chromosomu

A

pętla chromatyny

B

pętla chromatyny związana

z siatką lamin

C

pętla chromatyny związana

ze szkieletem jądrowym

D

pętla chromatyny związana

z białkami

E-H

tworzenie struktury chromosomu mitotycznego

- tzw. spagetti model

- struktura oparta na macierzy (szkielecie) jądrowej

- nowy model oparty na teorii koloidów

Wewnątrz jądra jest bardzo wysokie stężenie makrocząsteczek
100-200 mg/ml (najwyższe około 1000 mg/ml)

W tych warunkach aktywność chemiczna jest bardzo wysoka

np.

[A]+[B] [AB]

Faworyzowane jest tworzenie kompleksu białko-białko
(a nie tylko równowaga między wolnymi i związanymi cząsteczkami)

Niektóre struktury w jądrze przypominają właściwościami ciekłe kryształy
np. jąderko, ciałka PML itp.

Tworzenie struktury chromosomu może być faworyzowane w wyniku
efektu ‘załoczenia’ cząsteczek i występowania efektu wypychania (crowding efect)

Problem wolnych (niezwiązanych jonów i wody)

Modele struktury jądra komórkowego

Objętość wykluczona (różowy) i dostępna (niebieski)

w kwadratowej ‘klatce’ dla cząsteczek o różnej wielkości

Objętość wykluczona (różowy i czarny) oraz dostępna

(niebieski)

dla sferycznych cząsteczek o różnej wielkości

Model cytoplazmy pod powiększeniem ok.

1,000,000 razy

Minton A P J. Biol. Chem. 2001;276:10577-10580

Odkryta i opatentowana w 1948
I.B. Zbarskii i współpracownicy
Instytut Biologii Rozwoju, Moskwa

„residual nuclear protein fraction”

Powtórnie odkryta w 1974
R. Berezney i D.S. Coffey

„the nuclear matrix”

Macierz jądrowa

trawienie niespecyficznymi nukleazami np. DNAza I (i RNAza A)

ekstrakcja buforem z niejonowymi detergentami

ekstrakcja roztworami chlorku sodu 0.15-2 M

ekstrakcja roztworem 0.25 M siarczanu amonu

izolacja jąder komórkowych

komórka

białka

73-98%

(10-12% ogólnej zawartości białek jądrowych)

DNA

< 1%

(1-3% DNA)

RNA

0.05-1.2%

(20-30% jądrowego RNA)

fosfolipidy

0.5-7%

(2-9% fosfolipidów frakcji jądrowej)

skład macierzy bardzo zależy od sposobu jej otrzymywania !

etap tzw „stabilizacji”- jony Cu

2+

, ogrzewanie, traktowanie czynnikami stabilizującymi

mostki dwusiarczkowe

ekstrakcja dijodosalicylanem litu 25 mM (detergent)

Izolacja macierzy jądrowej

Skład macierzy jądrowej

laminy A-C
NuMA, dezmina

DNA topoizomeraza II
HMG1,2

SATB1
nukleolina

mt p53
Rb
kinaza kazeinowa 2

Białka niehistonowe, wykazujące wysokie powinowactwo do DNA:



białka blaszki jądrowej



resztkowe struktury jąderka



sieci wewnątrzjądrowej



rusztowania chromosomów (chromosome scaffold)



białka cytoszkieletu np. aktyna

Białka macierzy jądrowej

Zawartość zależy od sposobu izolacji macierzy:



hnRNA



snRNA (U1-U6 snRNA)



ślady rRNA

ok. 25% jądrowego RNA związane jest w macierzy jądrowej

RNA w macierzy jądrowej

ang. MAR, matrix associated regions, SAR, scaffold-associated regions
300-1000 pz, bogate w pary AT (średnio 70%)

nie ma sekwencji consensus, konstytutywne i funkcjonalne

przykład:

mozaika motywów TAAT, ATTA, TAAAT, ATTTTA i TAAAAT

również TGTTTTG, TTTTGGGG

polimorficzne: palindromiczne, Z-DNA
cechy strukturalne MAR:

zwiększona podatność na zaginanie DNA

zdolność do przyjmowania struktury

jednoniciowej (otwieranie struktury)

DNAza I

Rejony MAR w macierzy jądrowej

fabryka/chromomer

chromatyna/DNA

szkielet jądrowy

filamenty

pośrednie

pora jądrowa

filament

podstawowy

macierz

jądrowa

siatka lamin

Struktura chromosomu i jądra komórkowego

a macierz jądrowa



regulacja rozmieszczenia DNA w jądrze



porządkowanie struktury jądra i procesów w nim zachodzących



tworzenie continuum mechanicznego

z cytoszkieletem

Fukcjonalne znaczenie MAR
znajdują się w pobliżu lub zawierają rejony regulatorowe DNA
np. początki replikacji

rejony MAR mogą zwiększać ponad 1000-krotnie ekspresję obcych genów
w komórkach transfekowanych
(zniesienie efektu pozycyjnego?)

macierz

pętla

nić 30 nm

Funkcje macierzy jądrowej

Model struktury jądra

umiejscowiony czy rozproszony?

Model umiejscowiony struktury jądra wskazuje na

możliwość zachodzenia/regulacji procesów jądrowych

Główne różnice pomiędzy organizacją genomu

u Prokaryota i Eukaryota

prokaryota

eukaryota

wielkość genomu

600 kb - 9.5 Mb

3 Mb - 140 000 Mb

średnia wielkość
/ilość genu(ów)

950 bp/4300

2500 bp/19 000

horyzontalne
przenoszenie genów

częste

b. rzadkie

częstość sekwencji
niekodujących

rzadkie

b. częste

występowanie
intronów

rzadkie

powszechne

występowanie
powtórzeń genów

rzadkie

powszechne

haploidia

haploidia
/poliploidia

ploidalność

liczba
chromosomów

1

>1

heterozygotyczność

nie

tak

Strukturalne uwarunkowania procesów

zachodzących w jądrze komórkowym

W czasie transkrypcji i replikacji DNA

struktura chromatyny musi się zmieniać

W czasie replikacji DNA powinno się obracać

aby znieść wzrastającą ilość nadskręceń

topologia DNA regulowana jest przez enzymy – DNA topoizomerazy

Problemy topologiczne w DNA

Co porusza się w czasie replikacji :

kompleks polimerazy DNA czy samo DNA ?

dowód 1: system replikacyjny wirusa SV40 (antygen T)

dowód 2:

Istnienie kompleksów replikacyjnych

wykazano również w komórkach

Podobne pytania stawiano

nt. kompleksu transkrypcyjnego

Podczas procesu transkrypcji polimeraza RNA

i/lub matryca DNA muszą wykonywać

bardziej skomplikowane ruchy względem siebie

Istnieje analogia w ruchu kompleksu transkrypcyjnego

i układu śruba-nakrętka

Pozostaje jeszcze problem replikacji miejsc

gdzie spotykają się kompleksy replikacyjne

Problem replikacji końców liniowych cząsteczek DNA