Laboratoryjna

diagnostyka gruźlicy

Dr n. med. Aleksandra Safianowska

[e-mail]

Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych,

Pneumonologii i Alergologii

Warszawski Uniwersytet Medyczny

2012/13

M. tuberculosis complex



M. africanum (powszechny w Afryce)

•

M. africanum I (zach. Afryka, podobny do M. bovis),

•

M. africanum II (wsch. Afryka, podobny do M. tbc),



M. bovis

•

M. bovis subsp. bovis ( naturalnie oporny na

pyrazynamid),

•

M. bovis subsp. caprae (wrażliwy na pyrazynamid),

•

M. bovis BCG (szczepionka, terapia raka pęcherza),



M. canetti (Afryka, rzadko izolowany),



M. microti (u gryzoni),



M. pinnipedii (u fok),



M. tuberculosis.

*Ponad 140 gatunków

Podział prątków niegruźliczych*

wg

Runyona

PRĄTKI WOLNOROSNĄCE

(> 7 dni)

SZYBKO-

ROSNĄC

E

(<7 dni)

Typ I

Fotochromogen

ne

(zabarwienie

po

naświetleniu)

Typ II

Skotochromogen

ne

(silne

zabarwienie)

Typ III

Niechromogenne

(brak zabarwienia)

Typ IV

PATOGENNE

M. kansasii

M. marinum

M. interjectum

M. scrofulaceum

M. xenopi

M. avium

M. celatum

M. intracellulare

M. malmoense

M. xenopi

M.abscess

us

M.

chelonae

M.

fortuitum

NIEPATOGENNE

M. gordonae

M. flavescens

M.nonchromogenic

um

M.smegma

tis

Próbka kliniczna

Bakterioskopia

Hodowla

Rozmaz

+

Rozmaz

-

Biologia

molekularna

MTBC

NTM

Biologia

molekularna

MTBC

Raczej nie

MTBC

Wzrost

Brak

wzrostu

MTBC

Mycobacterium sp.

HPLC lub

biologia molekularna

+

-

-

Procedura w laboratoryjnej
diagnostyce zakażeń
prątkowych

HPLC – Wysokosprawna

chromatografia cieczowa

MTBC – Mycobacterium tuberculosis

complex

NTM – Non-tuberculous Mycobacteria

+

Materiał kliniczny - gruźlica płuc



3 x Plwocina odkrztuszona spontanicznie (3-

5 ml)

•

Nie – ślina!



Plwocina indukowana NaCl (3-5%),



Materiał pobierany w trakcie bronchoskopii

•

Popłuczyny oskrzelowe,

•

Płyn z płukania oskrzelikowo-

pęcherzykowego (Bronchoalveolar Lavage

Fluid – BALF),

•

Po bronchoskopii można pobrać

dodatkową próbkę plwociny.



Popłuczyny żołądkowe (pediatria).

Materiał kliniczny - gruźlica
pozapłucna



Materiał z ogniska chorobowego lub
z najbliższych okolic,



W miarę możliwości pobrać materiał
w jałowych warunkach, co pozwoli
na pominięcie etapu dekontaminacji.

Nie – krew!

•

Z wyjątkiem gruźlicy rozsianej i u
chorych na AIDS.

Materiał kliniczny - gruźlica
pozapłucna cd.

•

Płyny wysiękowe (opłucnowy, osierdziowy,
otrzewnowy);

•

Wycinki tkanek (opłucnej, węzłów chłonnych, skóry)

•

Materiał biopsyjny należy zanurzyć w soli
fizjologicznej;

•

Próbki w formalinie, nie nadają się dla badania
bakteriologicznego.

•

Wydzieliny z przetok, niegojących się ran;

•

Mocz zebrany po nocy– badanie wielokrotne
próbek o objętości co najmniej 200 mL;

•

Płyn mózgowo-rdzeniowy.

Bakterioskopia - barwienie

Ziehla-Neelsena



Wynik w czasie ≤ 24 godz.



Niska czułość (≥

10

4

bakterii/ 1ml).



Wynik negatywny nie wyklucza
gruźlicy!



Badanie nie różnicuje prątków MTBC
od NTM.



Dla próbek dodatnich zaleca się
badanie molekularne w celu
potwierdzenia lub wykluczenia MTBC.

Wynik badania mikroskopowego

Liczba prątków w

barwieniu

Ziehla-Neelsena

Wynik i opis

0 lub 1-2/ 300 pól
widzenia

Negatywny

1-9/ 100 pól widzenia

+
Prątki sporadyczne

1-9/ 10 pól widzenia

++
Prątki nieliczne

1-9/ 1 pole widzenia

+++
Prątki średnioliczne

>9/ 1 pole widzenia

++++
Prątki liczne

Bezpośrednie testy molekularne

(Nucleic Acid Amplification Testing, NAAT)



Testy komercyjne mają porównywalną,

bardzo wysoką swoistość oraz

pozytywną wartość predykcyjną

(>95%).



Czułość testów należy oceniać w

połączeniu z wynikiem mikroskopii.

•

Dla próbek dodatnich w rozmazie, czułość

>98%;

•

Dla próbek ujemnych w rozmazie, czułość

znacznie niższa, ok. 50-70%.

Interpretacja testu molekularnego
w połączeniu z wynikiem rozmazu

NAAT dodatni

NAAT ujemny

Rozma
z
dodat
ni

Potwierdzenie
gruźlicy



Prawdopodobne

prątki niegruźlicze

(NTM)



Wskazane

powtórzenie NAAT

Rozma
z
ujemn

y



Gruźlica wysoce

prawdopodobna



Wskazane

powtórzenie NAAT

Gruźlica

małoprawdopodobna
,

ale niewykluczona !

NAAT wykonujemy gdy:



Istnieje silne podejrzenie procesu
swoistego,



W rozmazie obecne są prątki
kwasooporne,



W hodowli wyizolowano szczep
atypowy, szybkorosnący.

Nie wykonujemy NAAT w trakcie

leczenia przeciwprątkowego.

Hodowla prątków



Czułość 80-85% (10 bakterii/1 ml),



Możliwość typowania i wykonania
testów lekowrażliwości,



Podłoże Loewensteina-Jensena

•

Pożywka jajowa z zielenią malachitową
hamującą wzrost większości nieswoistych
drobnoustrojów.



Automatyczne systemy hodowlane

*Morgan et al. JCM1983,18
:384-8.

Automatyczne systemy hodowlane



Przykłady: BACTEC 460 TB, BACTEC MGIT 960

(obydwa: Becton Dickinson, USA), MB/BacT System

(BioMerieux, Francja);



Pożywka płynna (podłoże Middlebrooka 7H12/7H9),

automatyczny system monitoringu metabolitów

- zwiekszonego wydzielania

14

CO

2

(BACTEC 460

TB) lub zużycia O

2

(pozostałe systemy);



Wyższa czułość, w szczególności dla materiałów

ujemnych w badaniu mikroskopowym*;



Systemy automatyczne stosuje się tylko

równolegle z hodowlą klasyczną, gdyż zdarza

się, że unikalne szczepy M. tuberculosis rosną

wyłącznie na pożywce Loewensteina-Jensena.

Czas oczekiwania na wynik hodowli



Na podłożu stałym:

•

MTBC - średnio 3-4 tygodnie,

•

Wynik ujemny po minimum 8

tygodniach.



W systemach automatycznych:

•

MTBC – do 2 tygodni,

•

Wynik ujemny po 6 tygodniach.

Typowanie prątków



Tradycyjne metody
biochemiczne, np.:

•

Test niacynowy, dodatni dla
M.tuberculosis, ujemny dla
M. bovis i pozostałych NTM,



Wysokosprawna
chromatografia cieczowa
(HPLC)



Metody genetyczne

-0,03

0,02

0,07

0,12

0,17

3

4

5

6

7

8

9

10

-0,03

0,02

0,07

0,12

0,17

3

4

5

6

7

8

9

10

M.tbc

M.avium

HPLC

HPL
C

Lekowrażliwość



Podstawowa, na leki pierwszego rzutu:

•

Streptomycyna (SM)

•

Izoniazyd (INH)

•

Ryfampicyna (RMP)

•

Etambutol (EMB)

•

Pyrazynamid (PZA)



Lekowrażliwość rozszerzona, gdy

•

Stwierdzono oporność na leki pierwszego rzutu,

•

Niepowodzenie/ przerwanie leczenia,

•

Nawroty choroby (hodowla+ po okresie

hodowli-),

•

Kontakt ze szczepem opornym.



Prątki niegruźlicze są naturalnie oporne na

leki pierwszego rzutu.

*W populacji polskiej, wśr
ód chorych wcześniej leczo
nych

Lekooporność



Lekooporność pierwotna – u chorych

nowowykrytych



Lekooporność wtórna - u chorych wcześniej

leczonych



Szczepy wielolekooporne typu MDR-TB

(multidrug resistant tuberculosis )

•

Oporne jednocześnie na INH i RMP;

•

Oporność na INH zazwyczaj poprzedza oporność na

RMP;

•

Oporność na RMP markerem oporności typu MDR*.



Szczepy extremalnie wielolekooporne typu

XDR-TB (extensively drug resistant tuberculosis)

•

Oporne na INH, RMP, fluorochinolon i co najmniej

jeden z dwóch leków: amikacynę lub kapreomycynę.

Molekularne testy lekowrażliwości



Wynik w dniu wykonania, ale nie zastępują

testów fenotypowych, wykonanych z hodowli.



Wskazania:

•

Niepowodzenie lub przerwa w leczeniu,

•

Pochodzenie chorego ze środowiska z

wysokim odsetkiem gruźlicy opornej,

szczególnie MDR-TB.



Xpert MTB/RIF (Cepheid, USA)

•

Real-Time PCR, czas wykonania 2 godz.

•

oporność RMP (rpoB).

Inne badania laboratoryjne – testy
serologiczne



Odpowiedź humoralna w gruźlicy nie ma

charakteru ochronnego.



Poziom swoistych przeciwciał oznacza się

w surowicy techniką ELISA (Enzyme Linked

Immunosorbent Assay).

Negatywna opinia WHO – zdecydowanie

nie zaleca się zastosowania testów

serologicznych w diagnostyce

gruźlicy płucnej ani pozapłucnej.

http://www.tbevidence.org/documents/policies/WHO_factsheet_serodiagnos

tics.pdf

Najczęstsze błędy - I

Jednoznaczna interpretacja wyniku

dodatniego mikroskopii jako gruźlicy.

Poza przypadkami gruźlicy, obecność
prątków kwasoopornych w rozmazie
może wynikać z:

•

kolonizacji prątkami saprofitycznymi,

•

kontaminacji prątkami środowiskowymi,

•

zakażenia oportunistycznego prątkami
niegruźliczymi powodującymi
mykobakteriozy.

Najczęstsze błędy - II

Brak typowania do gatunku wyrośniętych

szczepów prątków lub poprzestanie na

wykonaniu testu niacynowego

różnicujacego jedynie M.tuberculosis

od prątków niegruźliczych, w tym

M.bovis.

Nie pozwala to na:

•

diagnozowanie mykobakterioz,

•

wykrywanie systematycznych zanieczyszczeń

prątkami środowiskowymi.

Najczęstsze błędy - III

Zaniechanie wzywania na dodatkowe

badania mikrobiologiczne chorych ze

wskazaniami klinicznymi, u których

wyhodowano prątki niegruźlicze.

Z tej grupy rekrutują się chorzy na

mykobakeriozy.

Najczęstsze błędy - IV

  

Brak systematycznej oceny

mikrobiologicznej czystości

sprzętu endoskopowego.

Uwaga!

Ujemne wyniki badań

laboratoryjnych nie wykluczają

rozwoju choroby, bowiem żadna

z metod laboratoryjnych nie

charakteryzuje się

stuprocentową czułością.

Choroba a zakażenie



Aktywna gruźlica,

•

gdy infekcja wymyka się spod kontroli układu

immunologicznego.



Utajone zakażenie M. tuberculosis

(Latent Tuberculosis Infection, LTBI)

•

brak klinicznych i radiologicznych objawów

choroby;

GRUŹLICA

≠

ZAKAŻENIE

Rozpoznanie LTBI



Pośrednio, przez wykrycie odpowiedzi

immunologicznej na antygeny prątka

•

Test skórny (Tuberculin Skin Test, TST)

•

Testy IGRA (Interferon Gamma Release

Assays)



Dodatnie wyniki testów nie pozwalają

na odróżnienie choroby od zakażenia

Dodatni wynik TST lub IGRA nie jest

potwierdzeniem gruźlicy.

Test skórny (in vivo)



Wykrywa nadwrażliwość typu późnego
na antygeny tuberkuliny



Pomiar średnicy nacieku po 72 godz.



Reakcja skórna 6-8 tygodni po
zakażeniu



Mała swoistość – reakcja krzyżowa z M.
bovis BCG i prątkami środowiskowymi



Wpływ szczepienia BCG na wynik
utrzymuje się przez wiele lat.

Kryteria wyniku dodatniego TST

Średnic

a
nacieku

Grupa osób

≥5mm



Osoby HIV-pozytywne;



Osoby mające ostatnio kontakt z

prątkującym chorym;



Osoby ze swoistymi zmianami

radiologicznymi;



Chorzy po przeszczepie;



Chorzy leczeni immunosupresyjnie;



Chorzy poddani przewlekłej

kortykoterapii.

Kryteria wyniku dodatniego TST
c.d.

Średnica

nacieku

Grupa osób

≥10mm



Przyjezdni z rejonów o dużej zachorowalności na

gruźlicę;



Osoby uzależnione;



Bezdomni;



Rezydenci i pracownicy więzień, różnego rodzaju

domów opieki itp.;



Personel laboratorium mikrobiologicznego;



Dzieci <4 r.ż. po kontakcie z osobami z grupy ryzyka;



Chorzy na cukrzycę, niewydolność nerek, krzemicę,

nowotwory układu chłonnego, osoby wyniszczone.

≥15mm

Osoby spoza grupy ryzyka

Przyczyny fałszywie dodatnich
wyników TST



Po szczepieniu BCG;



Efekt booster,

•

Powiększenie się nacieku w wyniku

ponownego wykonania TST, mylnie
zinterpretowanego jako konwersja
odczynu;



W wyniku ekspozycji na prątki
niegruźlicze, powszechnie
występujące w środowisku.

Przyczyny fałszywie ujemnych
wyników TST



Wiek poniżej 6 miesięcy lub powyżej 65 lat,



Zaburzenia odpowiedzi komórkowej,



Zakażenia wirusowe (odra, ospa, różyczka), a w

szczególności HIV ,



Szczepienie żywymi szczepionkami w ciągu ostatnich

6 tygodni,



Ciężkie, wyniszczające choroby (np. prosówka,

nowotwory złośliwe)



Leczenie immunosupresyjne, również

glikokortykoidami



Okres przed wytworzeniem odpowiedzi komórkowej



Błąd wykonania/odczytu.

Testy IGRA (in vitro)



QuantiFERON®-TB Gold (Cellestis Limited,

Australia)



T-SPOT.TB (Oxford Immunotec Ltd., W. Brytania)



Ocena wydzielania IFN- γ przez limfocyty T

stymulowane antygenami swoistymi dla M. tbc



Duża swoistość – szczepienie BCG nie wpływa na

wynik



Kontrola „sprawności immunologicznej”

limfocytów T – ważne w immunosupresji



Wynik ujemny u dorosłych bez zaburzeń

odporności przemawia za wykluczeniem gruźlicy.

Diagnostyka LTBI



Nie dysponujemy żadnym testem bezpośrednim,

wykrywającym prątki M.tbc u bezobjawowo zakażonych

osób.



W populacji osób immunokompetentnych, IGRA ma

wysoką ujemną wartość predykcyjna (w szczególności w

kombinacji z ujemnym wynikiem TST.



U dzieci, w szczególności poniżej 5 roku życia, ujemny

wynik IGRA lub/i ujemny TST nie wykluczają rozwoju

aktywnej gruźlicy.



Żaden z testów nie różnicuje gruźlicy utajonej od

aktywnej lub przebytej choroby.



Żaden z testów nie jest polecany w diagnostyce aktywnej

gruźlicy.



Konsensus europejski dotyczący diagnostyki LTBI:

•

M. Korzeniewska-Koseła, Medycyna Praktyczna 2011/02.