ANALIZA USZKODZEŃ
DNA

23-24. 03. 2011
E. Ignatowicz

Przyczyny uszkodzeń DNA endogenne: błędy replikacji, reaktywne
formy tlenu
(źródła RFT w warunkach fizjologicznych i patologicznych)
Egzogenne: RFT pojawiające się w wyniku metabolizmu
ksenobiotyków (jakich?), ekspozycji na promieniowanie jonizujące i
UV, tworzenie dimerów pirymidynowych

Skutki działania RFT na kwasy nukleinowe: utlenianie zasad, tlenowa
deaminacja, przerwy pojedynczej/podwójnej nici, miejsca
apurynowe/apirymidynowe, wiązania krzyżowe, addukty DNA z
produktami peroksydacji lipidów

Uszkodzenia wynikające z działania interkalujacych związków
chemicznych (jakich?), toksyn roślinnych (psoralenów), toksyn
środowiskowych. Chemioterapia: leki alkilujące, antymetabolity.

Działanie policyklicznych węglowodorów aromatycznych na DNA –
ten temat można powiązać z analizą adduktów metodą

32

P –

postlabelingu.

USZKODZENIA DNA: MODYFIKACJA

ZASAD

•

I. POJEDYNCZE ZASADY

•

A. Deaminacja cytozyny do uracylu

•

B. Deaminacja adeniny do hipoksantyny

•

C. Alkilacja

•

D. Insercja lub delecja nukleotydu

•

E. Inkorporacja analogu zasady

•

F. Depurynacja

•

II. DWIE ZASADY

•

A. Indukowane światłem UV tworzenie dimerów

tyminy

•

B. Tworzenie wiązań krzyżowych

USZKODZENIA DNA: MODYFIKACJE

ŁAŃCUCHA

• III. PRZERWY POJEDYNCZEJ/PODWÓJNEJ NICI
• A. Promieniowanie jonizujące
• B. Reaktywne formy tlenu

• IV. WIĄZANIA KRZYŻOWE
• A. Pomiędzy zasadami w tym samym

łańcuchu lub łańcuchu dopełniającym

• B. Pomiędzy DNA i białkami, np. histonami

„ENDOGENNE” CZYNNIKI TWORZĄCE

WIĄZANIA KRZYŻOWE W DNA

• KWAS AZOTAWY POWSTAJE W ŻOŁADKU

Z PRODUKTÓW SPOŻYWCZYCH

• PRODUKTY PEROKSYDACJI LIPIDÓW

(MDA) → ETENOADDUKTY

• HCHO (wiązania krzyżowe DNA-białko i

białko-białko)

PROMIENIOWANIE KSENOBIOTYKI INFEKCJE AUTOUTLENIENIE

.

OH

PUFA

TOKSYCZNE ALDEHYDY

DNA

TLENOWE
MODYFIKACJE
ZASAD

ADDUKTY

PROMIENIOWANIE KSENOBIOTYKI INFEKCJE

.

OH

POŚREDNIE I BEZPOŚREDNIE ODDZIAŁYWANIE RFT Z
DNA

POWSTANIE MIEJSCA

APURYNOWEGO

Uszkodzenia DNA a mutacje

Naprawa uszkodzeń DNA – krótkie przypomnienie wiadomości z
biochemii
(BER, NER, MMR, NHEJ)

Odpowiedź komórek na uszkodzenia DNA

Cykl komórkowy, punkty kontrolne - krótkie przypomnienie wiadomości z
biochemii

Wywołanie biologicznych następstw

uszkodzeń DNA i schemat naprawy

DNA* - cząsteczka uszkodzona, DNA** - cząsteczka błędnie naprawiona

NAPRAWA USZKODZONEGO DNA

• Bezpośrednie „odwrócenie” uszkodzenia

– nie jest wymagana matryca, nie

zachodzi przerwanie pojedynczej nici:

– Tworzenie dimerów tyminy pod wpływem UV –

dodatkowe wiązania kowalencyjne pomiędzy

sąsiednimi T – fotoreaktywacja przy udziale

fotoliazy (aktywność zależna od absorpcji

światła 300-600 nm)

– Metylacja guaniny odwracana przez

aktywność MGMT (metylotransferaza), reakcja

stechiometryczna a nie katalityczna, 1

cząsteczka MGMT może być użyta 1x); MGMT

jest indukowana przez niskie dawki czynników

alkilujacych, warunkuje oporność komórek

nowotworowych na chemioterapię

ODPOWIEDŹ KOMÓREK NA USZKODZENIA DNA

TECHNIKI ANALITYCZNE SŁUŻĄCE DO

OCENY USZKODZEŃ DNA

• Elektroforeza kometkowa
• GC/MS
•

32

P-postlabeling

• Zsynchronizowana

spektrofotometria
fluorescencyjna

ELEKTROFOREZA KOMETKOWA

GC/MS

• Kolumna kapilarna wypełniona nośnikiem, stały przepływ gazu,

który nie reaguje z nałożoną próbką (argon, hel, wodór, azot)

• Spektrometria mas (MS): cząsteczki naładowane elektrycznie

przechodzą przez pole magnetyczne – rozpad naładowanych

cząsteczek i identyfikacja fragmentów obciążonych ładunkiem,

identyfikacja całej cząsteczki „poskładanej” z fragmentów

• Próbka do analizy MS musi mieć postać gazu (waporyzacja); w

komorze jonizacyjnej cząsteczki rozpadają się na jony w kolizji z

elektronami (M+ lub M

+

.); każdy jon indywidualnie wchodzi do

akceleratora. Wszystkie jony mają te samą energię kinetyczną.

Określone napięcie powoduje przejście tylko jednego

naładowanego fragmentu do detektora

• Zderzenie jonu z powierzchnią detektora wybija elektrony

(fotopowielacz – wzmocnienie ładunku)

• Elektrony wychwytywane w kolektorze – pomiar ładunku

• Masa proporcjonalna do wykrytego ładunku: m/z

• Wykres widma masowego: każdy pik odzwierciedla inny fragment

struktury cząsteczki; cząsteczka w całości – największa masa

widma (jon molekularny; „masa macierzysta”)

• Ograniczenia metody: zdolność rozdzielcza detektora

Policykliczne węglowodory

aromatyczne są kancerogenne

po aktywacji metabolicznej,

która może prowadzić do

powstawania adduktów –

produktów interakcji metabolitów

chemicznych kancerogenów z

DNA.

Addukty kancerogen - DNA

uważane są za krytyczne

uszkodzenia decydujące o

inicjacji procesu

nowotworowego.

32

P-POSTLABELING: WYKRYWANIE ADDUKTÓW,

np. kancerogen-DNA

W badaniach in vitro lub na zwierzętach możliwe jest
zastosowanie kancerogenów znakowanych izotopami
(tryt)

•

Wyizolowany DNA

jest hydrolizowany

enzymatycznie do

nukleotydów

Nukleaza P1

rozkłada

niezmodyfikowane

nukleotydy

Znakowanie

32

P

pozostałych

nukleotydów w

pozycji 5`

Chromatografia TLC

Autoradiografia

Hydroliza
enzymatyczn
a

Mikrokokalna
nukleaza
fosfodiesteraza II

Np(m

5

Cp+Cp+Tp+Ap+Gp)

+G

*

p+A

*

p

Nukleaza P

1

N+pi+G

*

p+A

*

p

32

P-

labeling

32

P-G

*

p+

32

P-

A

*

p

Rozdział
chromatograficzny

32

P-POSTLABELING

Pomiar

zsynchronizowanej

spektrofotometrii

fluorescencyjnej –

rejestrowanie

widma

fluorescencyjnego

przy zmiennej

długości fali

wzbudzenia i

emisji, ale przy

utrzymywaniu

stałej różnicy

między tymi
wartościami

Δλ=34 nm

a – wzorcowe

addukty

DNA:kancerogeny

b – DNA izolowane

z próby badanej

ZSYNCHRONIZOWANA SPEKTROFOTOMETRIA

FLUORESCENCYJNA