Biochemia kliniczna - wykład VII 30.03.2011

Temat: Uracyl w DNA - znaczenie biologiczne.

1. Ribonucleotide

2. Tematyka wykładu:

1. źródła obecności uracylu w DNA

2. 
   białko AID jest odpowiedzialne za przekształcanie C U w genach immunoglobulinowych (Ig)

3. enzymy usuwające uracyl z DNA

4. jaki jest endogenny poziom uracylu w DNA?

5. czy wzrost poziomu uracylu w DNA indukowany nieprawidłową ekspresją AID może być przyczyną karcynogenezy?

6. Regulacyjne funkcje uracylu w DNA?

Ad. a)

deaminacja cytozyny

• spontaniczna deaminacja cytozyny

• czas półtrwania cytozyny w jednoniciowym DNA wynosi ok 200 lat. W dwuniciowym DNA cytozyna jest zdecydowanie bardziej odporna na deaminację i jej czas półtrwania wynosi ok 30 000 lat.

• taka różnica znajduje odzwierciedlenie w różnym stopniu deaminacji cytozyny w komórkach zarówno S. cerevisiae i E. coli.

• deaminacja w przypadku drożdży S. cerevisiae jest 40razy szybsza prawdopodobnie dlatego, że okres trwania transkrypcji utrzymujy DNA w postaci jednoniciowych cząsteczek jest w tych komórkach dłuższy

• przypuszcza się, że w komórce człowieka w przeciągu doby ok. 100 - 500 cząsteczek cytozyny może zostać przekształconych w uracyl

włączanie dUMP do DNA w procesie replikacji

• dUMP jest niezbędnym intermediatem prowadzącym do syntezy tymidylanu

• biorąc pod uwagę stosunek puli dUTP/dTTP (0,2µM/ ~37 ± 30µM) oraz stwierdzony fakt, że polimerazy DNA uczestniczące w procesie replikacji mogą włączać dUMP z podobną wydajnością jak w dTMP, obliczono, że w trakcie replikacji DNA jedna cząsteczka dUMP może być włączona do DNA na 10⁴ inkorporowanych cz. dTMP)

Ad. b)

• liczbę różnych przeciwciał, jakie może produkować nasz ogranizm podczas całego okresu życia szacuje się na 10⁹, co przewyższałoby możliwość kodowania genomu człowieka

• Geny kodujące przeciwciała podlegają różnicowaniu w procesie somatycznej hipermutacji (SHM). Region zmienny V przeciwciał jest stabilny tylko do momentu aktywacji limfocytu B. Związanie antygenu indukuje proces mutacji somatycznych w regionie V, co prowadzi do większego różnicowania regionów zmiennych

Ad. c)

Enzymy usuwające uracyl z DNA

glikozydaza uracylowa - UNG

• podstawowy enzym usuwający z cząsteczki uracylu z DNA. UNG jest najbardziej aktywny wtedy, kiedy substratem jest ssDNA (jednoniciowy DNA), ale wykazuje także aktywność wobec dsDNA (dwuniciowego DNA), niezależnie od tego czy U tworzy pary zasad z G czy z A

• stopień ekspresji jest zależny od przebiegu cyklu kom. W jądrze, główna frakcja tego białka jest zlokalizowana w kompleksie replikacyjnym i oddziałuje z białkiem PCNA, RPA, XRCC1

• uważa się, że UNG2 jest białkiem replikacyjnym, przesuwającym się zgodnie z ruchem widełek replikacyjnych

SMUG (ang. Single stand-selective Monofunctional Uracyl DNA glycosylase)

• preferowanym substratem dla SMUG w dsDNA są pary zasad U:G

glikozydaza tyminowa TGD

glikozydaza MBD4

Ad. e)

Nieprawidłowe włączanie uracylu do DNA - implikacje klinicznie:

• wykazano, że nieprawidłowe włączanie uracylu do DNA, które jest rezultatem hamowania biosyntezy tymidylanu via inhibicja syntazy tymidylanowej, jest przyczyną cytotoksyczności

• biosynteza tymidylanu jest celem działania leków stosowanych w terapii przeciwnowotworowej (5-fluorouracyl, metotreksat), w leczeniu nowotworów głowy i szyi oraz taka piersi i jelita grubego

Ad. d)

Jaki jest endogenny poziom uracylu w DNA?

Opracowana w naszym laboratorium technika analizy uracylu w DNA opiera się na enzymatycznej degradacji DNA do nukleozydów i poźniejszej analizie dU metodą LC/MS/MS

Uzyskane przez nas wartości oscylują wokół 20 - 30 cząst. dU na 10⁶ nukleozydów w DNA izolowanym z leukocytów człowieka

(D. Gackowski, R. Oliński - dane niepublikowane)

Tabela: Mashiyama ST et al., Anal Biochem. 2008 Jan. 1:372 (1): 21-31

Ad. f)

Regulacyjne funkcje uracylu?

• poziom uracylu w DNA lawinowo wzrasta w procesie metamorfozy Drosophilia melanogaster. Jest to związane z zahamowaniem aktywności dUTPazy i UNG

(Vertessy BG, BBRC, 2007)

• zaobserwowano fizjologiczną ekspresję AID w spermatocytach, w jądrach człowieka

(Schreck S, Journal of Pathology Volume)

Co więcej, ekspresję AID zaobserwowano także w embrionalnych kom. macierzystych

• w jednym z niedawnych wydań Nature zademonstrowano, ze wysoki poziom mutacji obserwowany w DNA aktywnym transkrypcyjnie jest bezpośrednio związany z obecnością dużej ilości uracylu w tych odcinkach DNA

(Kim N. Jinks-Robertson, S., Nature 2009)

• niektóre białka regulatorowe, tj. represor lac E. coli i GCN4 rozpoznają specyficzne sekwencje regulatorowe w DNA, w których występuje uracyl zamiast tyminy

(Yansura)

3. „Postępy biochemii” (1): 2009 Oliński R., Jurgowiak M.

nadaktywność AID

transformacje

mutacje

4. Uracyl w DNA

Pojawiający się w genomie w miejscu cytozyny, uracyl jest jednym z najbardziej pierwotnych „uszkodzeń” DNA. Wydaje się, że w przebiegu ewolucji komórka „nauczyła się” wykorzystywać obecność uracylu w DNA w wielu procesach biologicznych, które nie są dla nas jeszcze w pełni poznane i zrozumiałe.

Oliński R., Jurgowiak M., Zaremba T.

(Uracil In DNA - its biological significance. Mutat. Res. Rev. Mutat. Res, 2010)

Warto przeczytać [!]

H. pylori

mutacje

C-T

inne

---