

Hodowle komórek roślinnych i zwierzęcych



Inżynieria tkankowa



Tkanki in vitro jako modele do badań

Kultury komórkowe i

tkankowe



Specyficzne działy biotechnologii



Polegają na kultywowaniu w war. sztucznych
wyodrębnionych komórek z tkanek roślin lub zwierząt
(komórki hodowane są nie wewnątrz tkanki a in vitro)



Wymagają specjalistycznych, bardziej zaawansowanych
technik niż hodowle mikroorganizmów (kom. są bardziej
wrażliwe niż drobnoustroje)

HODOWLE KOMÓREK ROŚLINNYCH
I ZWIERZĘCYCH



Totipotencjalny charakter komórek



Łatwiejsza hodowla in vitro niż kom. zwierzęcych



Materiałem zapoczątkowującym hodowlę jest eksplant przenoszony
na odpowiednie podłoże hodowlane (agar)



Po ok. 2-óch tygodniach otrzymuje się narośl niezróżnicowanych
komórek (tzw. kalus)



Zmieniając skład pożywki można uzyskać zróżnicowanie tkanki
kalusowej i odtworzenie całej rośliny



Istnieje możliwość osobnego hodowania wyodrębnionych komórek i
tkanek roślinnych (np. samych korzeni lub zarodków)



W tkankach wyhodowanych in vitro występują na ogół takie same
związki biologicznie czynne jak w roślinie macierzystej, co
umożliwia ich pozyskanie z pominięciem hodowli całej rośliny.

HODOWLE KOMÓREK ROŚLINNYCH

HODOWLA KOMÓREK ROŚLINNYCH IN
VITRO

roślina

eksplant

eksplant

kalus

hodowla

inkubacja



Zastosowanie w :



Badaniach fizjologii wzrostu i różnicowania komórek



Doskonaleniu odmian roślin hodowlanych (w połączeniu z fuzją
protoplastów)



W produkcji alkaloidów, olejków aromatycznych, fitohormonów,
składników leków (np. nasercowych), sterydów i ich pochodnych.

HODOWLE KOMÓREK ROŚLINNYCH

1.

Pojedyncze komórki uzyskuje się w
wyniku enzymatycznego, chemicznego
lub mechanicznego rozdrobnienia
odpowiedniej tkanki.

2.

Komórki hoduje się w odpowiednich
butelkach z pożywką (medium
hodowlanym) w inkubatorze  tak
uzyskane komórki to kultura pierwotna

3.

Następnie komórki przenosi się do
świeżej pożywki (pasażuje) i uzyskuje
się  kulturę wtórną

4.

Operację pasażowania można powtarzać
wielokrotnie, uzyskując linię komórkową,
jednak w związku z ograniczoną
możliwością wzrostu komórki po
pewnym czasie ulegają apoptozie.

HODOWLE KOMÓREK
ZWIERZĘCYCH

Ciągłe linie komórkowe

W specyficznych przypadkach uzyskuje się ciągłą linię

komórkową tzn. komórki zdolne do nieograniczonej replikacji
in vitro. Wiele ciągłych linii komórkowych uzyskuje się z
komórek rakowych.

Linie komórkowe są przechowywane w ciekłym azocie (-196 C)

w bankach komórek i tkanek i sa dostępne komercyjnie
(zwykle €100)

ATCC- American Tissue Culture Collection
ETCC- European Tissue Culture Collection

HODOWLE KOMÓREK ZWIERZĘCYCH



Hep2(human liver cells)



EBL (embrio bovine lung cells)



Vero (monkey kidney cells)



V-79 (Chinese hamster kidney cells)



MG63 (osteoblast-like human cells)



Saos2 (human osteoblast-loke cells)



Baron (human fibroblasts)



U-937 (human monocyte-like line)

PRZYKŁADY LINII KOMÓRKOWYCH:

Media hodowlane (pożywki)



Zawierają: aminokwasy, witaminy,

sole Na, K, Ca, MG, Cl, PO, HCO,
glukozę 0.9g/l, osocze z krwi cielęcej 5-10%,
antybiotyki, hormony, czynniki wzrostu, pierwiastki śladowe

HODOWLE KOMÓREK
ZWIERZĘCYCH

WARUNKI HODOWLI

pH: optymalne dla komórek 7,4
utrzymywane jest poprzez zachowanie
odpowiedniego stężenia CO2 (5%) w
inkubatorze

Temperatura: 37 C

Sterylne warunki pracy z
komórkami

W hodowli komórek zwierzęcych stosuje się dwie techniki:



Na stałym nośniku



W zawiesinie

Niektóre komórki (tzw. powierzchniowo zależne) mogą rosnąć

tylko na powierzchni stałej. Inne , wywodzące się z krwi lub
limfy (np. limfocyty T i B) mogą być hodowane tak jak
drobnoustroje- w zawiesinie w bioreaktorach do hodowli
wgłębnej.

TECHNIKI HODOWLI KOMÓREK
ZWIERZĘCYCH

HODOWLA NA STAŁYM NOŚNIKU

Butelki płaskie

Komórki rosną na
dnie butelki

Szalki Petriego

Komórki rosną na dnie szalek

Mikrokuleczki

Zawieszone w pożywce
w bioreaktorze do
hodowli wgłębnej.

Komórki rosną na
powierzchni kuleczek

Kapilary

Z materiałów półprzezroczystych
w bioreaktorze
do hodowli wgłębnej

Komórki rosną na
powierzchni kapilar



Ten typ hodowli przypomina klasyczna hodowlę
mikroorganizmów, jednakże z uwagi na wrażliwość komórek
stosuje się bardzo umiarkowane mieszanie i napowietrzanie.



W celu uniknięcia osadzania komórek,

ściany pokrywa się substancjami
antyadhezyjnymi oraz dodaje
składniki przeciwdziałające
agregacji komórek (np. proteazy)

HODOWLA W ZAWIESINIE



Wytwarzanie szczepionek wirusowych

Namnożone komórki zaraża się wirusem, następnie komórki poddaje

się lizie a z płynu pohodowlanego wydziela się wirusy lub antygeny



Wytwarzanie interferonów

Związki hamujące rozwój wirusów w komórce( interferon α

wytwarzany przez leukocyty, interferon β przez fibroblasty,
interferon γ- przez limfocyty T  obecnie mogą być otrzymywane w
wyniku hodowli in vitro



Wytwarzania przeciwciał monoklonalnych

Przeciwciała specyficzne przeciwko jednemu, ściśle określonemu

antygenowi



Oceny cytotoksyczności substancji



Oceny skuteczności leków



Odtwarzania tkanek i narządów- inżynieria tkankowa

ZASTOSOWANIE HODOWLI
KOMÓREK ZWIERZĘCYCH



Nowa ,interdyscyplinarna dziedzina wiedzy, której celem jest zastąpienie,
przywrócenie, udoskonalenie lub podtrzymanie funkcji tkanek i narządów,
uszkodzonych w wyniku urazu, choroby przewlekłej lub schorzeń
wrodzonych.



Przy pomocy implantów zawierających komórki własne pacjenta, osadzone
na specjalnych trójwymiarowych podłożach.



Komórki hodowane na płaskich podłożach, zachowują się jak
„indywidualne ” komórki, natomiast na podłożach 3D wytwarzają
przestrzenną tkankę.

INŻYNIERIA TKANKOWA

Robotyk

a

Genetyk

a

Inżynieria

materiałow

a

Praktyka

kliniczna

Biologia

molekularn

a

Biochemi

a

Fizjologi

a

INŻYNIERIA TKANKOWA -
ETAPY



Pobranie tkanki od pacjenta



Wyizolowanie i założenie

hodowli komórek in vitro



Osadzenie komórek na

trójwymiarowym rusztowaniu
(3D), stymulacja czynnikami
wzrostu



Dalsza hodowla w bioreaktorze

w warunkach in vitro



Implantacja w ciele pacjenta



Biozgodne  brak cytotoksyczności

 brak wł. kancerogennych
 brak wł. mutagennych
 brak wł. alergizujących



Łatwe (możliwe) przetwórstwo



Podatne na sterylizację



Ulegające biodegradacji / bioresorpcji



O odpowiedniej mikrostrukturze i właściwościach
powierzchniowych

WŁAŚCIWOŚCI MATERIAŁÓW NA
PODŁOŻA KOMÓRKOWE -
WYMAGANIA

PODŁOŻA TRÓJWYMIAROWE -
RODZAJE

włóknina

litografia

Kryształki soli (porogen)

INŻYNIERIA TKANKOWA-
REKONSTRUKCJA
CHRZĄSTKI
Z WYKORZYSTANIEM
AUTOGENICZNYCH
CHONDROCYTÓW

 Pobranie chrząstki pacjenta

 Laboratoryjna hodowla komórek

 W trakcje operacji chora chrząstka
zostaje zastąpiona wyhodowanymi
chondrocytami



Zastosowanie: badania in vitro toksyczności, drażnienia, mutagenności,

fototoksycznośc



Wykorzystywane przez: firmy farmakologiczne, kosmetyczne, chemiczne,

do oceny nowych biomateriałów

MODELE TKANEK DO BADAŃ WŁAŚCIWOŚCI BIOLOGICZNYCH MATERIAŁÓW

MODELE TKANEK LUDZKICH DOSTĘPNE KOMERCYJNIE

Nabłonek oddechowy

Nabłonek jamy ustnej

Skóra ludzka
(keratynocyty i melanocyty)

Rogówka