24.02.2015r.

Zaliczenie z ćwiczeń wtedy co zaliczenie z wykładów.

Roślinne kultury tkankowe – aseptyczne kultury komórek, tkanek i organów, wyizolowanych z roślin macierzystych, prowadzone in vitro (łac. W szkle) na syntetycznych pożywkach, w ściśle określonych warunkach fizycznych i chemicznych

Eksplantaty – wyizolowane fragmenty roślin.

Historia roślinnych kultur in vitro

XIX w.: teoria komórkowa (Schwann, Schleiden, Virchov)

1902: ogłoszenie przez Haberlandta teorii totipotencji komórek: każda żywa komórka zdolna jest do odtworzenia całego organizmu

Lata 20 i 30: kultury odciętych wierzchołków wzrostu korzeni, niedojrzałych zarodków

1939: kultury ciągłe tkanek roślinnych (Daucus carota, Nicotiana glauca x N. langsdorfii)

Lata 50: koncepcja hormonalnej kontroli organogenezy (Skoog, Miller)

Lata 50: kultury zawiesin, mnożenie z wierzchołków wzrostu, odwirusowywanie, mnożenie pąków bocznych, opisanie somatycznej embriogenezy (1958 r., Reinert i Steward uzyskali zarodki somatyczne z kalusa Daucus carota)

Lata 60: regeneracja roślin z pojedynczych komórek marchwi i tytoniu, androgeniczne haploidy, zapylenie in vitro, kultury zalążni, kultury protoplastów

Lata 70: mieszańce somatyczne, kultury mikrospor

Lata 80: PRAKTYCZNE ZASTOSOWANIE KULTUR IN VITRO W HODOWLI I PRODUKCJI, kultury roślin drzewiastych, zmienność somaklonalna, selekcja in vitro, transformacja, produkcja metabolitów wtórnych

Tok prac technicznych

- uprawa roślin w polu, szklarni lub w warunkach regulowanych

Lepiej izolować jest eksplantaty z roślin matecznych rosnących w warunkach kontrolowanych. Rośliny mateczne powinny być zdrowe, w dobrej kondycji fizjologicznej. Ważny jest również wiek rośliny (lepiej pobierać eksplantaty z roślin młodych) oraz ważny jest również wiek organów, z których izolujemy eksplantaty.

- mycie i sterylizacja szkła laboratoryjnego i narzędzi

- przygotowywanie i sterylizacja pożywek

- przygotowywanie i dezynfekcja materiału roślinnego

- izolacja i wykładanie eksplantatów na pożywkę

- pasażowanie kultur

Przenoszenie kultur na nową pożywkę, co 4-6 tygodni

- przenoszenie roślin z kultur do warunków naturalnych i wzrost ex vitro

DEZYNFEKCJA MATERIAŁU ROŚLINNEGO

Etapy:

1. Wstępne oczyszczenie i cięcie roślin

2. Dezynfekcja chemiczna (wstępna i właściwa)

Na mieszadle magnetycznym, na wytrząsarce, poprzez zanurzanie w środku odkażającym, oprysk środkiem odkażającym

1. Płukanie w wodzie destylowanej sterylnej

Przerwanie działania środka dezynfekcyjnego, płukamy 3 raz przez 10-20 minut

ŚRODKI STOSOWANE DO DEZYNFEKCJI

1. Podchloryn wapnia Ca(OCl)2

2. Podchloryn sodu NaOCl

3. Chloramina T

4. 8-hydroksychinolina

5. Sublimat HgCl2

6. Woda bromowa

7. Woda utleniona

8. Alkohol etylowy

ACE, DOMESTOS

Czas i stężenie należy dobrać specjalnie do każdego organu!

Rodzaje eksplantatów:

1. Zawierające komórki niezróżnicowane, zdolne do podziałów

- merystemy pierwotne: merystemy wierzchołkowe pędów i korzeni, merystemy pachwinowe, merystemy interkalarne

- merystemy wtórne: kambium (miazga), fellogen (miazga korkotwórcza, wytwarzana przez perycykl), archespor męski, archespor żeński

2. Zawierające komórki zróżnicowane, nie zdolne do podziałów, ale zdolne do odróżnicowania

Komórki rdzenia

Korzenia i pędu

Komórki kory

Komórki skórki

3. Komórki niezdolne do odróżnicowania

Komórki bardzo zróżnicowane, wyspecjalizowane strukturalnie i fizjologicznie

Włoski, sklerenchyma, cewki, włókna, komórki przyszparkowe

Pożywki:

- White (1943)

- Murashige i Skoog (1962) – MS

- Gamborg (1968) – B5

- Linsmaier I Skoog (1965) – LS

- Nitch I Nitch (1969) – NN

- Chu (1978) – N6

Makroelementy

Mikroelementy

Związki organiczne

• Witaminy (kwas nikotynowy PP, tiamina B1, pirydoksyna B6)

• Mezoinozytol -> prekursor witaminy

Witamina E i C – opóźniają utlenianie tkanek eksplantatów i ich brunatnienie

- aminokwasy

- glicyna

- cukier (najczęściej sacharoza, może być glukoza, maltoza, fruktoza)

Węgiel aktywowany dodajemy w celu absorbcji wydalin i wydzielin komórkowych z pożywki mający negatywny wpływ na rośliny

- Składniki pochodzenia naturalnego (ekstrakty drożdżowe, ekstrakty z bulw ziemniaczanych, z bananowca, woda kokosowa, mleczko kokosowe, wyciągi z siewek)

Odczyt pożywki stosujemy w granicach od 5,6-5,8

- substancje zestalające (przy pożywkach stałych): agar (naturalny wyciąg z krasnorostów), agaroza, gerlit, fitożel

SKŁADNIKI MINERALNE

- ORGANOGENY: C, H, O

- NIEMETALE: N, S, P, B – jako aniony

- METALE ALKALICZNE: K, Na, Mg, Ca – jako kationy

- METALE CIĘŻKIE: Fe, Mn, Cu, Zn, Mo – jako kationy lub chelaty metali

AZOT – białka, enzymy, aminokwasy, kwasy nukleinowe

- forma nieorganiczna NO3- lub NH4+, azotany, sole amonowe

- forma organiczna aminokwasy (glicyna, glutamina)

SIARKA – białka, aminokwasy, witaminy

- forma nieorganiczna siarczany, SO4 2-

FOSFOR – cukrowce, nukleotydy, kwasy nukleinowe

- związki nieorganiczne, pochodne kwasu ortofosforowego H2PO4-, HPO4-

POTAS – synteza białek, fosfosynteza, aktywator enzymów

- związki nieorganiczne azotany, fosforany, siarczany, K+

MAGNEZ – chloroplasty, aktywator enzymów w procesie fotosyntezy i oddychania, rybosomy

- związki nieorganiczne siarczan magnezu Mg2+

WAPŃ – ściany komórkowe, budowa błon cytoplazmatycznych, transport auksyn, mitochondria

- sole wapnia rozpuszczalne w wodzie, azotany najłatwiej, siarczany trudniej Ca2+