Inicjacja kultur

kalusowych

wybranych

gatunków roślin

Kalus

Tkanka roślinna powstająca w miejscu zranienia rośliny
najczęściej z okolicznych komórek tkanki miękiszowej. Jest to
amorficzna masa komórek mająca zwykle postać białego
nalotu. Komórki tworzone przez te merystemy powodują
stopniowe zabliźnianie się i zarastanie ran. Komórki kalusa są
zwykle większe od komórek tkanki macierzystej.
Kalus stanowi bezkształtną masę niezróżnicowanych i szybko
dzielących się komórek. Może być wyprowadzony z prawie
każdej tkanki roślinnej poprzez traktowanie jej mieszaniną
hormonów roślinnych (auksyn i cytokin w takim samym
stężeniu). Tak wytworzony kalus w zależności od warunków w
jakich się będzie rozwijać (tj. stężenia hormonów) może ulec
ponownemu zróżnicowaniu w kierunku pędów lub korzeni,
włącznie z odtworzeniem całej rośliny. Hodowle in vitro kalusa
znajdują szerokie zastosowanie w badaniach nad fizjologią i
genetyką roślin.
Kalus jest również jedną z faz embriogenezy somatycznej -
odpowiednio pobudzona część rośliny przechodzi wszystkie
stadia rozwoju zarodkowego, tworząc w efekcie nowe organy, a
nawet cały organizm - tak zwana totipotencją Małe kawałki
rośliny ulegają najpierw różnicowaniu tworząc właśnie kalus, a
następnie ponownie się różnicują budując pędy, korzenie itp.

•Pożywka do indukcji kalusa z siewek
pomidora:

Pożywka MS :
-0,3 mg/dm3 KIN
-0,1 mg/dm3 NAA
-sacharoza 30000 mg/dm3
- agar 8000 mg/ dm3

•Pożywka do indukcji kalusa z korzenia
marchwi:

Pożywka MS :
-0,3 mg/dm3 KIN
-0,1 mg/dm3 NAA
-sacharoza 30000 mg/dm3
- agar 8000 mg/ dm3

Wykonanie i przebieg

doświadczenia

•

Materiał roślinny: siewki ogórka (eksplant wtórny), korzeń marchwi

•

Wykonanie:

•

Przygotowanie komory laminarnej

•

Sterylny materiał roślinny wyjąc ze słoików i umieścić na sterylnej szalce w

celu izolacji eksplantatu

•

Siewki pomidora: liścienie dzieli się na 4 części a hypokotyl przekraja

wzdłuż następnie tak pocięte fragmenty umieszcza się na pożywce MS+ 0,8

D + 0,4 BAP

•

Korzeń marchwi:

•

Czynności w warunkach niesterylnych: dokładne wyszorowanie pod bieżącą

woda następnie zalanie całych korzeni w dużej zlewce 20% r-r Ace,

pozostawienie na 30min.

•

Z Ace przenosimy korzeń pod komorę, 3 – krotnie płuczemy wodą sterylną

dest. Odcinamy 2 cm fragmentów na końcach a następnie odcinamy

poprzeczne krążki o grubości ok. 1cm i dzielimy je na 8 części następnie

umieszczamy na pożywce stałej

•

3. Fragmenty siewki pomidora umieszczamy w pokoju hodowlanym w temp

24-26 stopni C na świetle. Fragmenty korzenia marchwi umieszczamy w

ciemności w temp 25 stopni Celsjusza.

Komory laminarne

Obserwacje

•Hodowla fragmentów siewek pomidora
po około tygodniu hodowli została
zakażona drobnoustrojami. Hodowle
przeniesiono do autoklawowania.

•W hodowlach fragmentów korzenia
marchwi po około 2 tygodniach hodowli
zaobserwowano pojawienie się kalusa w
obrębie kambium.

Korzeń marchwi

Siewki pomidora

Wnioski

•Dzięki zdolnościom totipotencjalnym komórek
roślinnych możliwe jest powstanie kalusa a następnie
redyferencja czyli różnicowanie organów roślinnych.

•W kulturze in vitro można zainicjować wytwarzanie
kalusa wykorzystując dowolny organ i tkankę. Do kultury
kalusa nadają się komórki posiadające żywotne jądro
komórkowe, nieuszkodzone błony plazmatyczne i niezbyt
grubą ścianę komórkowa.

•W celu inicjacji kalusa na ekspnatacie do pożywki
niemal zawsze należy dodać regulatory wzrostu. U roślin
jednoliściennych potrzebny jest zwykle tylko dodatek
auksyny, w innych przypadkach tylko cytokininy lub
równocześnie cytokininy i auksyny

•Na fragmentach korzenia marchwi w miejscu
„zranienia” w obrębie kambium (merystemu
pierwotnego) powstał kalus natomiast w hodowli
fragmentów siewek pomidora doszło do zakażenia, ale
oczekiwanym wynikiem było powstanie kalusa ze
„zranionej” tkanki liściowej i tkanki hypokotylu.