Biotechnologia 6

Problemy związane z mikrorozmnażaniem:

1. Mutacje (niestabilność genotypu) związane z następującymi czynnikami:

1. Wybranym rozmnażaniem in vitro

2. Rodzajem stosowanego regulatora wzrostu

3. Charakterem eksplantatu (tkanka różnicująca się lub różnicowana)

4. Rodzajem genotypu

5. Poziomem ploidalności

6. Pochodzenie eksplantatu (z tkanki jednorodnej czy chilery)

2. Indukcja organogenezy i zarodków somatycznych

3. Ukorzenianie drzew i krzewów

4. Wytwarzanie toksycznych związków, tzw. metabolitów wtórnych

5. Przenoszenie do gleby (regeneracja korzeni, adaptacja liści do prawidłowej funkcji i nieaseptycznych warunków)

6. Witryfikacje - choroba fizjologiczna (tylko w kulturach in vitro)

7. Infekcje zewnętrzne

Ad.6 zaburzona gospodarka wodna i węglowodanowa (rośliny nie do uratowania) - silnie pogrubione liście

Uzyskiwanie in vitro roślin o nowych cechach

Wytworzenie cechy przeznaczonej do modyfikacji

↓

Ustalenie szlaku przemian biotechnologicznych związanych z daną cechą

↓

Określenie enzymów katalizujących kluczowe ogniwa szlaku metabolicznego

↓

Identyfikacja genów kodujących główne enzymy kontrolujące dany szlak metaboliczny

↓

Przeprowadzenie modyfikacji genetycznej:

• Blokada syntezy danego enzymu

• Wzmocnienie syntezy enzymów ograniczających wydajność przemian w danym szlaku metabolitów

• Wprowadzenie obcych genów w celu skompletowania, reaktywowania lub uruchomienia nowego szlaku metabolicznego

↓

Analiza ekspresji nowej cechy

↓

Potwierdzenie technologicznej przydatności danego surowca

↓

Badania związane z bioryzykiem i bezpieczeństwem konsumenta

• Roślinne kultury in vitro umożliwiają otrzymanie roślin o zmienionym kierunkowo genotypie

• poznanie mechanizmów rozwoju umożliwia praktyczne wykorzystanie totipotencji i zdolności regeneracyjnych izolowanych komórek roślinnych do otrzymywania roślino nowym genotypie, na potrzeby człowieka

• rośliny te znalazły szerokie zastosowanie w rolnictwie, leśnictwie, ogrodnictwie, w farmacji i medycynie i różnych gałęziach przemysłu

• Są to rośliny, które mogą zapewnić wyższe plony, być uprawiane na terenach zasolonych lub zdegradowanych, być odporne na atak patogenów, charakteryzują się lepszą jakością (smak, kolor, wrażenia estetyczne) zwiększona zawartość określonych związków chemicznych

Metody pozyskiwania roślin o nowych cechach:

1. Selekcja

2. Haploidyzacja

3. Krzyżowanie generatywne i somatyczna hybrydyzacja - mieszance międzygatunkowe i międzyrodzajowe

4. Transformacje - rośliny transgeniczne

Ad.1 selekcja w kulturach in vitro

Polega na identyfikacji i wyłonieniu określonych, poszukiwanych przez człowieka cech. Uzyskanie nowej odmiany w warunkach naturalnych z zastosowaniem tradycyjnych metod hodowli roślin wymaga długiego czasy (średnio 10-20 lat)

Alternatywna jest selekcja w kulturach in vitro. Prowadzi się ją w kulturach protoplastów, zawiesin komórkowych, mikrosporach, kalusie, zarodkach somatycznych lub zygotycznych, ziarnach pyłku, fragmentach organów oraz siewek.

Rodzaje zmienności:

Zmiany pojawiające się w materiale roślinnym mogą mieć podłoże genetyczne (dziedziczne) oraz epidemiczne (pozagenetyczne i niedziedziczne):

• Zmienność gametoklonalna - dotyczy komórek generatywnych

• Zmienność somaklonalna - dotyczy komórek somatycznych

Podstawą selekcji w kulturach in vitro jest zmienność somaklonalna

Zamienność somaklonalna

Niedziedziczna

(w wyniku wpływu warunków kultury, regulatorów rozwoju…)

Możliwa do wykorzystania tylko w przypadku rozmnażanie wegetatywnego, np. dla ozdobnych

Dziedziczna

(Spontaniczna lub indukowana)

Mechanizm powstania tej zmienności taki sam jak w przypadku mutacji (dotyczy genomu jądrowego, plastydowego i mtochondrialnego)

Indukowanie zmienności somaklonalnej:

• Mutageny chemiczne IN-metylo-N nitrozofosforomocznik-MNH

• Fizjologiczne - promieniowanie UV i gamma

Selekcja i kontrola uzyskanych zmian

Uzyskane zmiany mogą mieć charakter letalny lub recesywny i prowadzić do wielu niepożądanych anomalii, stąd konieczność prowadzenia selekcji. Czynnik selekcyjny dodaje się do pożywki, na której znajduje się materiał roślinny. Rodzaj, stężenie i czas działania, rodzaj kultury, reakcja komórek na jego działanie decydują o skuteczności selekcji.

Ad.2 Haploidyzacja:

• Haploidy to rośliny o gametycznej (haploidalnej, n) liczbie odnośników w komórce somatycznej

• Haploidy są roślinami niepłodnymi, konieczne jest zatem podwojenie ich genomu. Podwojenie następuje spontanicznie (bardzo rzadko) lub jest indukowane w kulturach in vitro, najczęściej za pomocą kolchicyny. W efekcie powstaje homozygota, podwojony haploid - DH

• Podwojone haploidy tak uzyskane charakteryzują się większą wydajnością, są doskonałym obiektem badan i transformacji.

Haploidy w kulturach in vitro można otrzymać w wyniku kilku procesów:

1. Androgenezy in vitro - kultury mikrospor i pylników

2. Ginogenezy in vitro - kultury niezapłodnionych zalążków i zalążni

3. Eliminacji chromosomów - kultury mieszańców międzygatunkowych i między rodzajowych

Androgeneza

Wydajna metoda pozyskiwania haploidów z gamet męskich. Obecnie na dużą skalę uzyskuje się haploidy roślin zbożowych: jęczmienia zwyczajnego, kukurydzy zwyczajnej, pszenicy zwyczajnej, ryżu siewnego. Również inne rośliny takie jak: ziemniak, papryka.

Gynogeneza:

Uzyskuje się haploidy w wyniku rozwoju komórek gametofitu żeńskiego (tj. woreczka zalążkowego) oraz w kulturach niezapłodnionych zalążków i zalążni.

1. Partenogeneza in vitro - rozwój niezapłodnionej komórki jajowej

2. Apogamia in vitro - rozwój synergid lub antypody, często praktykuje się zapylenie zdegenerowanym pyłkiem (promienie x lub gamma)

Przykłady z partenogenezy → burak zwyczajny, cebula uprawna, sałata siewna

Poprzez apogamię - grusza i jabłoń domowa, melon, ogórek siewny, petunia ogrodowa

Ad.3 krzyżowanie generatywne i hybrydyzacja somatyczna (patrz pozyskiwanie protoplastów)

Mieszance płciowe - powstają jako skutek krzyżowania generatywnego czyli po krzyżowym zapyleniu in vitro lub in vivo dwóch odległych taksonów. Mieszance mogą dalej rozwijać się wyłącznie w warunkach in vitro. Po regeneracji mieszańca są zazwyczaj niepłodne, stąd poddaje się je kolchicynowaniu (celem duplikacji genomu) lub rozmnaża się wegetatywnie. Mieszance płciowe wykorzystuje się do otrzymywania nowych gatunków, odmian lub linii hodowlanych, nieistniejących w naturze.

Przykłady: pszenżyto, truskawka, (Fragaria x ananasa), jeżyna bezkońcowa, goździk ogrodowy

Ad.4 Rośliny transgeniczne:

Metody wprowadzania obcych genów

Mikrowstrzeliwanie

Cel zabiegów:

• Odpornych na biotyczne czynniki środowiska

• Odpornych na abiotyczne czynniki środowiska

• O zmodyfikowanych cechach użytkowych (zmieniony metabolizm i węglowodany)

• Wytwarzających przeciwciała i szczepionki

Odporność na wirusy:

• Otrzymuje się najczęściej przez wprowadzenie do genomu rośliny gonów odpowiedzialnych za syntezę biała apsydowego

• Pojawieniem się tego białka w roślinie powoduje opóźnienie lub brak symptomów chorobowych, bowiem uniemożliwione jest namnażanie wirusa. Dokładny mechanizm działania tej ochrony nie jest bliżej znany.

• Inne możliwości transformacji polegają m.in. na wprowadzeniu do genomu roślinnego wirusowego RNA, orientacji antysensownej lub satelitarnego RNA

Odporność na owady i nicienie:

• Źródłem do transgenezy roślin odpornych na owady i nicienie są geny z bakterii Bacillus thuringensis o charakterze endotoksyny, które w przewodzie larw owadów hamuje ich dalszy rozwój

• Ta toksyna okazała się również skuteczna w odporności na nicienie

• Oprócz Bt możliwe jest wprowadzenie innych genów podnoszących odporność na szkodniki m.in. warunkujących syntezę inhibitorów proteaz lub neuropeptydów

Odporność na bakterie i grzyby:

• Wprowadzenie odporności tego typu jest najmniej zaawansowane z powodu poligenowego charakteru tej cechy

• Istnieje możliwość wprowadzenie genów kodujących typu PR, np. glukanazę, chitynazę lub lizozymy

• Obiecujące są różniez prace nad wprowadzeniem genów odpowiedzialnych za syntezę fitoaleksyn i innych substancji o charakterze antymikrobowym

• Przykładem - transformowanie protoplastu tytoniu, genem syntazy stylbenowej z orzecha (Arachis hypogaea) odpowiedzialnej za syntezę silnie toksycznej fitoaleksyny - resweratolu

• Korzystny wpływ na podnoszenie odporności mają również modyfikacje prowadzące do nadekspresji genów kodujących enzymy antyoksydacyjne oraz niskocząsteczkowe antyutleniacze

http://www.pg.gda.pl/chem/Katedry/Leki_Biochemia/index.php?option=com_content&view=article&id=16&Itemid=27

---