KULTURY TKANKOWE ROŚLIN – ZALICZENIE

1. Pomieszczenia do pracy w kulturach In vitro

Organizacja pomieszczeń laboratoryjnych zależy od wielkości przetwarzanego materiału roślinnego oraz organizacji pracy. Istnieje jednaj najważniejsza zasada, a mianowicie elementy sterylne muszą być oddzielone od niesterylnych.

-pokój do pożywek

-pokój prac sterylnych

-pokoje/komory wzrostowe

-komora szklarniowa/pokój wegetacyjny

-pomieszczenia gospodarcze

1. Wyposażenie pomieszczeń

-komory laminarne

-regały do hodowli roślin w warunkach in vitro

-komory klimatyczne

-inkubatory z chłodzeniem

-autoklaw, sterylizatory narzędzi

-szkło i narzędzia laboratoryjne (szalki, pęsety, skalpele)

1. Sprzęt do przygotowania pożywki

-lodówki, chłodziarki, zamrażarki

-waga

-stacja odwróconej osmozy, woda ultraczysta

-pHmetr

-mikrofala

-autoklaw, sterylizatory

-filtry do filtracji na zimno

-drobny sprzęt: pipety, końcówki, szkło, folia aluminiowa, łyżeczki

1. Warunki sterylizacji pożywki

Sterylizacja w autoklawie

warunki: 120°C przy przez 30 minut przy nadciśnieniu 0,2MPa.

(nie stosuje się w przypadku substancji termolabilnych)

1. Postępowanie ze składnikami termolabilnymi – filtracja

Stosowane są jednorazowe, sterylne filtry mechaniczne, o średnicy porów 0,2µm.

1. Przygotowanie narzędzi do sterylizacji

- idealnie czyste

- suche

- odpowiednio opakowane

- odpowiednio ułożone w komorze sterylizatora

1. Przygotowanie komory laminarnej

przed rozpoczęciem pracy:

włączamy nawiew,

stół dokładnie myjemy wata nasączona 70% EtOH,

włączamy UV na 20-30 min i włączamy przed rozpoczęciem pracy,

w trakcie pracy stół przecieramy EtOH,

używamy tylko sterylnych narzędzi

wszystko, co umieszczamy w komorze laminarnej musi być najpierw zdezynfekowane

1. Niezbędne narzędzia do pracy w komorze

-70% EtOh do odkażania

-Watka do przemywania

-Szalki do podpierania narzędzi

-Pęsety

-Skalpele

-Wyparzarka do narzędzi

-Sterylny papier do podkładki

-Materiał do pracy (kultury, rośliny)

-Pożywka

-Kosz na odpadki (w pobliżu komory)

1. Zakładanie kultur

-kultury z marchwii; organogeneza pośrednia

-kultury indukcja pędów kontowych z kończyny; mikropropagacja

-formowanie organów przybyszowych z begonii i łusek cebuli; organogeneza przybyszowa

-kukurydza; somatyczna embriogeneza

-rzepak; ukorzenianie roślin wyhodowanych z ziaren

Etapy:
-odkażenie komory laminarnej

-przygotowanie sterylnych narzędzi

-sterylizacja materiału roślinnego

-przygotowanie pożywki

-wysiew sterylnego materiału na pożywkę w warunkach jałowych

-inkubacja, wzrost materiału

1. Dezynfekcja

1. Rodzaje

-autoklawowanie: pożywki, narzędzia

-wyrzażanie: narzędzia

-dezynfekcja chemiczna: materiał roślinny

-dezynfekcja mechaniczna: składniki termolabilne pożywek

-suche gorąco: szkło

-promienie UV: komora laminarna

1. Etapy

Liście: umyć, odciąć ogonki liściowe, zlewkę i płytkę przetrzeć 70% EtOH,

liście w zlewce zalać 70% EtOH, zlać i zalać 20% domestosem na 45minut,

płukać w wodzie destylowanej 2x 10 minut

Nasiona: 70% EtOH, 20% domestos 15 minut, płukać wodą destylowaną 2x 10

Minut

1. Środki stosowane:

Etanol 70%

Woda destylowana

Domestos 20%

Chloramina 0,5-1%

HgCl 0,2-1%

Woda chlorowa