Metody

immunologiczne

Opracowała: Agata

Śniegowska

Metody immunochemiczne z

zastosowaniem znacznika:

1. radioimmunologiczne (izotopowe)

2. immunoenzymatyczne (nieizotopowe)

3. immunofluorescencyjne (nieizotopowe)

Metoda radioimmunologiczna (RIA)

• Wykrywanie promieniowania izotopów promieniotwórczych

w odniesieniu do składowej reakcji antygen – przeciwciało,

• antygen lub przeciwciało znakowane jest izotopem,
• przy pomocy znanych ilości antygenu lub przeciwciała

tworzy się równoległą krzywą niezbędną do porównania
otrzymanego wyniku,

• reakcja może przebiegać w środowisku płynnym lub

stałym,

• metoda charakteryzuje się dużą czułością.

Metody radioimmunologiczne można podzielić na:

•

kompetycyjną (współzawodnictwa),

•

bezpośrednią.

Metoda kompetycyjna

• Zachodzi reakcja pomiędzy

przeciwciałem a oznaczonym
antygenem w obecności znanej ilości
znakowanego izotopem antygenu,

• zarówno znakowany, jak i

nieznakowany antygen
współzawodniczą o przeciwciało,

• metoda ta jest stosowana, m.in. do

oznaczania hormonów, enzymów,
białek płodowo – nowotworowych.

Metoda kompetycyjna

Etapy przebiegu reakcji:

1) interakcja przeciwciało – antygen (antygen przyczynia się

do utworzenia dwóch frakcji: związanej i niezwiązanej),

2) rozdział i izolacja (kompleks powstały ze związania

znakowanego antygenu z przeciwciałem oddziela się z
mieszaniny poprzez wysalanie wysokimi stężeniami soli,
np. siarczanem amonu),

3) odczyt poziomu radioaktywności (wynik stanowi stosunek

promieniowania związanego z kompleksem do całkowitej
ilości podanego izotopu).

Metoda bezpośrednia

• Znakowany antygen poddaje się reakcji z

materiałem, w którym poszukujemy
danych przeciwciał.

• Powstały kompleks (znakowany antygen –

przeciwciało) wytrąca się z roztworu, a
następnie mierzy radioaktywność związaną
z osadem.

• Stężenie badanego przeciwciała uzyskuje

się z wykonanej równolegle krzywej
kalibracyjnej.

Metody nieizotopowe

W metodach tych zamiast izotopu
stosuje się inne znaczniki, np.
enzymy, fluorochromy.

Ze względów bezpieczeństwa
metody nieizotopowe stosowane są
częściej aniżeli izotopowe.

Metoda immunoenzymatyczna

(EIA)

• W metodzie tej antygen lub przeciwciało sprzęga

się z enzymem, a pomiar produktu powstającego
w reakcji enzymatycznej rozkładającej określony
substrat jest miernikiem ilościowym.

• Produkt reakcji jest barwny. Natężenie barwy

zależy pośrednio od zawartości oznaczanego
antygenu, czy przeciwciała i jest mierzone z
użyciem metod spektrofotometrycznych.

• Najczęściej stosowanymi enzymami są:

fosfataza alkaliczna (AP)

- peroksydaza chrzanowa (HRP)
- oksydaza glukozowa (GO)

Metoda immunoenzymatyczna

(ELISA)

TEST ELISA jest jednym z
najpowszechniej stosowanych testów
w badaniach biomedycznych
(naukowych oraz diagnostycznych).
Służy do wykrycia określonych białek
w badanym materiale z użyciem
przeciwciał poliklonalnych lub
monoklonalnych skoniugowanych z
odpowiednim enzymem.

Metody immunoezymatyczne

(ELISA)

Są to metody heterogenne (jedna z
reakcji składowych jest związana z
fazą stałą).
Wyróżnia się:

• metody kompetycyjne,
• metody pośrednie,
• metody kanapkowe.

Metoda kompetycyjna

(ELISA)

• Obowiązująca tu zasada jest podobna do metod

kompetycyjnych izotopowych. Przeciwciało
związane jest jednak z fazą stałą. Badany
antygen współzawodniczy z antygenem
znakowanym (enzymem, fluorochromem).
Zależność związana z przyłączaniem się
antygenu do przeciwciała jest odwrotnie
proporcjonalna do przeciwciała znakowanego.

• Natężenie zabarwienia jest tym większe, im

mniejsza zawartość badanego antygenu.

Metoda pośrednia

(ELISA)

• Faza stała (powierzchnia płytki) opłaszczana jest

antygenem. Następnie umieszczane są badane
przeciwciała, które w czasie inkubacji wiążą się z
opłaszczonym antygenem. Po płukaniu dodaje się
przeciwciała skierowane przeciw badanym
białkom, znakowane enzymem (metody
immunoenzymatyczne) lub fluorochromem
(metody immunofluorescencyjne). Po inkubacji
ocenia się natężenie fluorescencji lub natężenie
zabarwienia po dodaniu substratu (w przypadku
metod immunoenzymatycznych). Wartości te są
proporcjonalne do zawartości oznaczanego
przeciwciała.

• Metoda stosowana do oznaczania danych

przeciwciał, np. przeciw DNA, przeciw określonym
wirusom, przeciwciał anty-HIV.

Metody kanapkowe

(ELISA)

• Probówki lub mikropłytki opłaszczane są przeciwciałem.

Dodawany jest badany antygen, który w czasie
inkubacji wiąże się z przeciwciałem. Po płukaniu
umieszcza się przeciwciała skierowane przeciw
badanym antygenom, znakowane enzymem lub
fluorochromem. Po inkubacji ustala się natężenie
fluorescencji lub natężenie zabarwienia po dodaniu
substratu (w metodach immunoenzymatycznych).

• Stosowane są do oznaczania różnych antygenów, np.

immunoglobulin, składowych dopełniacza, wirusa
Epsteina-Barra.