Analiza
sekwencyjna
peptydów i białek

Anna Domżalska

Chemia; sem. VI

2012/2013

Peptydy i białka



Są to polimery aminokwasów, w
których poszczególne aminokwasy
zwane resztami aminokwasowymi,
połączone są wiązaniami amidowymi (
inaczej peptydowymi)

Ala – Ser

OH

N

N

H

2

O

O

N

H

2

H

H

H

OH



N CH CO



Peptydy zapisujemy tak, by

aminokwas N-końcowy był po
lewej stronie a aminokwas C –
końcowy po prawej

aminokwas C – końcowy – z wolną grupą –
aminokwas N – końcowy – z wolną grupą –



 

Szkielet białkowy



Jakie aminokwasy wchodzą w skład

peptydu?



Ile jednostek każdego z aminokwasów

występuje w peptydzie?



W jakiej kolejności występują one w

łańcuchu peptydowym?

Określanie struktury peptydów

Rozbicie

peptydu na

składowe

aminokwasy

Rozbicie

peptydu na

składowe

aminokwasy

• hydroliza w roztworze

kwaśnym powoduje

racemizację

Analiza

mieszaniny

aminokwasów

Analiza

mieszaniny

aminokwasów

• Rozdział metodą

chromatograficzna

Analiza mieszaniny
aminokwasów



Nałożenie na szczyt szklanej

kolumny chromatograficznej
wypełnionej specjalnym
adsorbentem i przepuszczanie
przez kolumnę buforów



Różne aminokwasy poruszają się

z różną prędkością a więc znajdą
się w różnym czasie na dnie
kolumny => są rozdzielane w
miarę „ wychodzenia” z kolumny



Po wyjściu z kolumny każdy z aminokwasów
miesza się z roztworem ninhydryny =>
fioletowe zabarwienie

+

−𝑂�;�

2

𝑂;−𝑅𝐶𝑂�;−𝐶𝑂

2

 

Kolor
fioletowy

OH

OH

O

O

N

H

2

O

O

H

R

O

O

NH

O

-

O



Rejestracja różnych czasów

eluncji =>

oznaczenie rodzaju aminokwasów



Intensywność fioletowej barwy

rejestrowana przez spektrometr
=> ilość aminokwasu

Określenie struktury peptydu -
sekwencjonowanie



Sekwencjonowanie – określenie w jakiej
kolejności aminokwasy są ze sobą
połączone



Sekwencjonowanie wykonuje się przez
kolejne odrywanie po jednym aminokwasie
z końca łańcucha peptydowego

( albo z C – końca albo z N-końca)



Aminokwas jest wydzielany i
identyfikowany

Degradacja Edmana



Polega na dodawaniu do peptydu



 

+

�

2

𝑁𝐶�𝐶𝑂𝑁�𝐶�𝐶𝑂𝑁�𝐶�𝐶𝑂𝑁� −

 

𝑅 ′

 

𝑅 ′′

 

𝑅 ′′ ′

 

− 𝑁�𝐶− 𝑁�𝐶�𝐶𝑂𝑁�𝐶�𝐶𝑂𝑁�𝐶�𝐶𝑂𝑁� −

 

𝑅 ′′ ′

 

𝑅 ′′

 

𝑅 ′

 

�

 

𝑁𝑎�𝐶 𝑂

3

 

N

S



Kolejnym etapem jest łagodna hydroliza

− 𝑁�𝐶− 𝑁�𝐶�𝐶𝑂𝑁�𝐶�𝐶𝑂𝑁�𝐶�𝐶𝑂𝑁� −

 

𝑅 ′′ ′

 

𝑅 ′′

 

𝑅 ′

 

�

 

+

¿

�

¿

 

+

 

𝑅 ′′

 

𝑅 ′′ ′

 

N- fenylotiohydantoina

N

NH

S

R

O



Mając peptyd o skróconym łańcuch możemy
powtórzyć postępowanie



Z kolei otrzymaną N – fenylotiohydantoinę
identyfikuje się chromatograficznie w
porównaniu ze znanymi pochodnymi PTH
typowych aminokwasów

�

2

𝑁𝐶�𝐶𝑂𝑁�𝐶�𝐶𝑂𝑁� −

 

𝑅 ′′

 

𝑅 ′′ ′

 

+

…

N

S

Sekwencjonowanie dużych peptydów i białek



Degradacja Edmana jest niepraktyczna

(ograniczenie metody do ok. 50 cykli)



Stosuje się rozbijanie łańcucha
peptydowego przez częściową hydrolizę na
wiele mniejszych fragmentów



Określa się sekwencję każdego z tych
fragmentów



Fragmenty dopasowuje się

Hydroliza peptydu



Wodnym roztworem kwasu

Jest ona nieselektywna i prowadzi do
przypadkowej mieszaniny małych
fragmentów



Enzymatyczna – jest specyficzna

trypsyna arginina i lizyna

chymotrypsyna fenyloalanina,
tyrozyna,
tryptofan

𝑉𝑎�−𝑃h�−𝐿��−𝑀��−𝑇𝑦�−𝑃��−𝐺�𝑦−𝑇��−𝐶𝑦�−𝐺��−𝐴��−𝐼��−𝐿𝑦�−���−𝐴��−�𝑖�

 



TRYPSYNA



CHYMOTRYPSYNA

𝑉𝑎�−𝑃h�−𝐿��−𝑀��−𝑇𝑦�−𝑃��−𝐺�𝑦−𝑇��−𝐶𝑦�−𝐺��−𝐴��−𝐼��−𝐿𝑦�−���−𝐴��−�𝑖�

 

𝑉𝑎�−𝑃h�−𝐿��−𝑀��−𝑇𝑦�−𝑃��−𝐺�𝑦−𝑇��−𝐶𝑦�−𝐺��−𝐴��−𝐼��−𝐿𝑦�−���−𝐴��−�𝑖�

 



Analiza reszty N – terminalnej – polega
na użyciu 1– fluoro-2,4- dinitrobenzenu,
który ulega nukleofilowemu
podstawieniu wolną grupą aminową

+

�

2

𝑁𝐶�𝐶𝑂𝑁�𝐶�𝐶𝑂𝑁�𝐶�𝐶𝑂𝑁� −

 

𝑅 ′

 

𝑅 ′′

 

𝑅 ′′ ′

 

− 𝑁�𝐶�𝐶𝑂𝑁�𝐶�𝐶𝑂𝑁�𝐶�𝐶𝑂𝑁� −

 

𝑅 ′′ ′

 

𝑅 ′′

 

𝑅 ′

 

𝑁𝑎�𝐶 𝑂

3

 

Analiza reszty terminalnej - Sanger

F

N

+

O

-

O

N

+

O

-

O

N

+

O

-

O

N

+

O

-

O

− 𝑁�𝐶�𝐶𝑂𝑁�𝐶�𝐶𝑂𝑁�𝐶�𝐶𝑂𝑁� −

 

𝑅 ′′ ′

 

𝑅 ′′

 

𝑅 ′

 

+

¿

; �

2

𝑂 ; ∆

�

¿

 

−𝑁�𝐶�𝐶𝑂𝑂�

 

𝑅 ′

 

+

�

3

𝑁𝐶�𝐶𝑂𝑂�

 

𝑅 ′′

 

+

+

…

N

+

O

-

O

N

+

O

-

O

N

+

O

-

O

N

+

O

-

O

Analiza reszty terminalnej



Analiza reszty C – terminalnej – jest to metoda
enzymatyczna nie chemiczna. Resztę tę usuwa
się selektywnie za pomocą karboksypeptydazy,
która rozszczepia tylko wiązania peptydowe
przylegające do wolnych grup karboksylowych w
pozycji α w łańcuchach polipeptydowych.



Czynność tę można powtórzyć ze skróconym
peptydem i analizować kolejną grupę



W przypadku długich łańcuchów stosuje się
częściową hydrolizę i analizuje otrzymane
fragmenty

Bibliografia



Robert Thornton Morrison, Robert
Neilson Boyd; Chemia organiczna; Tom
2; wydanie piąte; Wydawnictwo
Naukowe PWN; Warszawa 2011; str.
366-372



John McMurry; Chemia organiczna;
część 4; Wydawnictwo Naukowe PWN;
Warszawa 2012;

str. 998-1005