Diagnostyka molekularna chorób

dziedzicznie uwarunkowanych na

przykładzie dystrofii mięśniowej

.



O chorobach dziedzicznych mówimy wtedy,
gdy schorzenie spowodowane przez mutacje
jednego bądź więcej genów lub też aberrację
chromosomową jest przekazywane w rodzinie
w kolejnym pokoleniu. Swoistym wyjątkiem są
mutacje występujące de novo, odpowiedzialne
za wystąpienie chorób, które nie są
przekazywane następnym pokoleniom ze
względu na letalność lub uniemożliwienie
prokreacji. Zmiany w DNA zostają wniesione
wraz z gametami rodziców, bądź też (jako
mutacje) następują we wczesnych podziałach
zygoty.

Dystrofia mięśniowa
Duchenne’a



Dystrofia mięśniowa Duchenne’a (DMD) jest
najczęstszą i najcięższą z postępujących dystrofii
mięśniowych (częstość – 1:3600 żywo urodzonych
chłopców). Łagodniejszą odmianą jest dystrofia
mięśniowa Becker’a (BMD). Dystrofia mięśniowa
Duchenne’a była po raz pierwszy opisana przez
francuskiego neurologa Guillaume’a Benjamin’a
Amand’a Duchenne’a w roku 1860. Dystrofia
mięśniowa Becker’a była nazwana przez
niemieckiego lekarza Peter’a Emil’a Becker’a w
1950 roku, który po raz pierwszy opisał wariant
DMD.



Postępująca dystrofia mięśniowa typu Duchenne’a
(DMD) jest chorobą genetyczną powodującą
upośledzenie ruchu i bardzo często paraliż kończyn,
szczególnie nóg. Po urodzeniu i we wczesnym okresie
niemowlęcym, poza niekiedy obserwowaną wiotkością,
chorzy chłopcy rozwijają się prawidłowo. Dopiero około
drugiego roku życia zmiany genetyczne zaczynają być
widoczne. Charakteryzują się one symetrycznym
osłabieniem mięśni obręczy biodrowej, kołyszącym,
„kaczkowatym” chodem, tendencją do chodzenia na
palcach, trudnością we wchodzeniu po schodach i
wstawaniu z pozycji leżącej. Odruchy kolanowe
początkowo osłabione, z czasem zanikają całkowicie,
dłużej utrzymują się odruchy skokowe. Dolegliwości te
narastają z wiekiem. Dystrofia mięśniowa Becker’a
(DMB) to „bliźniacza” odmiana DMD o niemal
jednakowym obrazie klinicznym, lecz o łagodniejszym
przebiegu. Jej objawy są widoczne dopiero około 11
roku życia, a nawet dopiero w wieku dojrzałym. Chorzy
są długo sprawni, potrafią samodzielnie się poruszać.



W latach 80 odkryto przyczynę obu dystrofii. W roku
1986 naukowcy odkryli, że dystrofie mięśniowe
Duchenne’a oraz Beckera powodują mutacje w genie
kodującym białko dystrofiny. Gen ten mieści się na
chromosomie X, co powoduje, że prawie wyłącznie na
tą odmianę dystrofii mięśniowej chorują chłopcy. W
przypadku DMD mutacja jest tak duża, iż niemożliwa
jest produkcja białka w związku z czym komórki
mięśniowe są całkowicie pozbawione dystrofiny w
błonie komórkowej. BMD jest powodowana przez inne
mutacje w obrębie tego samego genu. Mutacje te
umożliwiają produkcję dystrofiny lecz jej jakość i ilość
jest również niewystarczająca na prawidłowe
funkcjonowanie komórek mięśniowych (jej masa
cząsteczkowa jest mniejsza niż dystrofiny prawidłowej).
Częściowe zachowanie funkcji dystrofiny może mieć
związek z późniejszym wystąpieniem objawów
klinicznych oraz z łagodniejszym przebiegiem choroby. 

Dystrofina i gen DMD



Gen kodujący dystrofinę jest największym
genem występującym w organizmie ludzkim,
zajmuje około 0,1% całego ludzkiego genomu i
1,5% chromosomu X. Składa się w 99% z
intronów. Gen kodujący dystrofinę jest
ogromnym i fascynującym genem
charakteryzującym się złożonością regulacji
transkrypcji, funkcji i oddziaływań białko-białko.
Dopiero powoli zaczynamy rozumieć zależności
i mechanizmy funkcjonowania genu i jego
produktu – dystrofiny. Dzięki rozwojowi biologii
molekularnej ustalono, że mutacje w genie DMD
odpowiedzialne są za powstawanie dystrofii
mięśniowych Duchenne ´a i Beckera.



Dystrofina jest białkiem
kodowanym przez gen leżący
na chromosomie X. Opisano
wiele mutacji występujących
w tym genie, z których
większość zmienia ekspresję
dystrofiny w komórce.
Mutacje te wywołują choroby
zwane dystrofiami
mięśniowymi Duchenne’a i
Becker’a. Jest jeszcze kilka
innych tkanek, w których
występują izoformy
dystrofiny, takie jak tkanka
nerwowa czy siatkówka oka.



Mutacja jednej z izoform
dystrofiny występującej w
mięśniach serca powodują
kardiomiopatie.



Rola dystrofiny polega na
"uszczelnianiu" błony
komórkowej, dzięki czemu
zachowuje ona selektywną
przepuszczalność (m.in. nie
wypuszczając enzymów na
zewnątrz).

Jest białkiem

strukturalnym, zapewniającym
wytrzymałość błony komórkowej
mięśni. Dystrofina chroni
również komórki mięśniowe
przed nekrozą, a także pełni rolę
pośrednika podczas komunikacji
międzykomórkowej
(jest
fosforylowana m.in.: przez
kinazy prolinowe).

Rys1. Lokalizacja dystrofiny w tkance mięśniowej



Znając miejsca wiązania aktyny przez dystrofinę
można badać molekularne podstawy dystrofii
Duchenne’a i Becker’a. Rearanżacja genów, która
występuje u około ¾ pacjentów, jest wynikiem dużych
delecji i duplikacji oraz mutacji punktowych. Delecje
są bardzo pospolitymi zmianami w genie dystrofiny.
Stanowią około 75% ogólnych mutacji. Duplikacje
występują nieco rzadziej (5-15% pacjentów). Mutacje
punktowe pojawiają się u około 20-35%
pacjentów.

 Istnieje wiele przykładów delecji części

genu. Najczęściej mutowany region to domena N-
końcowa, a dokładnie egzony 2-19 oraz dalej
położone egzony 45-55. Delecja w tych egzonach
prowadzi do skrócenia dystrofiny, której brakuje
od 11 do 217 aminokwasów.

Rys.2 Wpływ różnych
delecji na ramkę odczytu
genu dystrofiny (A).
Delecja egzonu 4 (B),
egzonów 7-11 (C)
zachowuje ramkę odczytu.
Delecja egzonu 7 prowadzi
do utraty ramki odczytu
(D)

Rys.3.
Molekularna
organizacja
dystrofiny w
połączeniu z
kompleksem
glikoproteinowym
oraz F-aktyną.
Pokazana jest
normalna i
zmutowana
struktura
dystrofiny



Dystrofina, która zawiera mutacje jest

niestabilna, co powoduje zaburzenia w
utrzymywaniu prawidłowych interakcji
pomiędzy dystrofiną a aktyną, przyczyniając
się jednocześnie do zaburzeń w strukturze
całego cytoszkieletu i powodując zmiany w
budowie błony biologicznej.

Diagnostyka molekularna i rozpoznanie



Problemy wczesnej diagnostyki chorób genetycznych, a
także poszukiwanie metod skutecznej ich terapii stanowią
jedno z ważniejszych zagadnień współczesnej medycyny.



Praktyczne zastosowanie w diagnostyce klinicznej wielu
chorób uwarunkowanych genetycznie w tym także dystrofii
mięśniowej typu Duchenne’a i Beckera znajdują metody
analizy DNA.



Podstawą teoretyczną umożliwiającą zastosowanie analizy
kwasów nukleinowych w diagnostyce chorób genetycznie
uwarunkowanych jest to, że każda komórka organizmu
zawiera w jądrze zakodowaną w DNA, pełną informację
genetyczną oraz, że wszelkie zmiany dziedziczne muszą
znaleźć swoje odbicie w strukturze DNA.



Stosowane są różne techniki, których celem

jest najbardziej efektywna detekcja mutacji.
Dystrofia mięśniowa Duchenne'a/Beckera
(DMD/BMD) jest chorobą recesywną sprzężoną
z płcią, będącą następstwem mutacji w genie
dystrofiny. Ustalanie nosicielstwa choroby
nadal przysparza trudności spowodowanych
dużym rozmiarem genu DMD i wysoką
częstością rekombinacji wewnątrzgenowych.

Rys.4. Sposób
przekazywania
chorobym
sprzężonej z
chromosomem X
przez kobietę
nosicielkę.

Pewne nosicielstwo jest wówczas, gdy

rodzona siostra badanej kobiety ma syna
z dystrofią mięśniową typu Duchenne’a
lub gdy rodzony brat badanej ma objawy
choroby.

Strategia diagnostyki molekularnej:



Duże zmiany genowe :delecje, duplikacje ,

insercje



Delecje mogą być wykryte metod Southerna

lub PCR-Multiplex.



W duplikacjach najczęściej stosuje się metody

ilościowe: Q-PCR.



Diagnozowanie chorób genetycznie

uwarunkowanych, dla których nie jest znany
ani produkt badanego genu, ani molekularny
charakter zmian prowadzących do
wystąpienia schorzenia umożliwia analiza
markerów polimorficznych. Im bliżej
analizowane markery są sprzężone z badanym
genem (z mutacją w tym genie), tym mniejsza
możliwość rekombinacji i tym pewniejszy
wynik analizy.



Do różnicowania (wykrywania) alleli danego markera
polimorficznego wykorzystuje się najczęściej analizę RFLP.
Badanie to może być wykonane na DNA chromosomowym za
pomocą hybrydyzacji z odpowiednio wyznakowaną sondą
molekularną lub za pomocą metody PCR. W tym drugim
przypadku poszczególne allele identyfikuję się w procesie
elektroforezy na żelu. Porównuję się wielkość powielonych
produktów lub ich fragmentów powstałych po cięciu DNA
enzymem restrykcyjnym. W dystrofii mięśniowej Duchenne’a i
Beckera około 75% mutacji stanowią delecje. Ich identyfikacja
polega na jednoczesnym powielaniu z zastosowaniem kilku par
starterów, tych fragmentów genu DMD, w których delecje
występują najczęściej. Taka „wielokrotna” PCR umożliwia ze
stosunkowo niewielkim nakładem pracy i odczynników,
równoczesne „przeszukanie” dużych fragmentów genu.



Metoda multipleks PCR polega na jednoczesnej
amplifikacji kilku fragmentów DNA, różniących się
wielkością. W praktyce sprowadza się to do umieszczenia
w jednej mieszaninie reakcyjnej kilku par starterów. W ten
sposób możliwa jest amplifikacja kilku regionów jednego
lub kilku genów.



Interpretując wyniki uzyskane metodą PCR, należy
pamiętać, że najczęstszą przyczyną braku amplifikacji nie
jest nieobecność sekwencji matrycowej DNA, lecz po
prostu hamowanie enzymu polimerazy przez
zanieczyszczenia lub błąd techniczny. Amplifikację
równoczesną wykorzystano na przykład w diagnostyce
molekularnej dystrofii mięśniowej Duchenne'a.

Real-time PCR



PCR w czasie rzeczywistym jest metodą

ilościowego oznaczania DNA. Metoda ta
pozwala na monitorowanie zmian stężenia
produktu PCR poprzez pomiar fluorescencji
proporcjonalnej do jego ilości w czasie trwania
reakcji. Fluorescencja pojawia się dzięki
zastosowaniu barwników, np.: bromku etydyny
lub sond flurescencyjnych (Scorpions, TaqMan
itp.).

Kliknij ikonę, aby dodać obraz

Metoda Southerna



DNA chromosomowy jest cięty wybranym enzymem
restrykcyjnym, a powstałe fragmenty rozdziela się w
zależności od wielkości (masy cząsteczkowej) w żelu
agarozowym. Tak uporządkowane fragmenty DNA
przenosi się techniką Southerna na odpowiedni filtr i
hybrydyzuje ze specyficzną sondą, wyznakowaną, np.:
izotopem promieniotwórczym. W czasie hybrydyzacji
cząsteczki sondy łączą się tylko z tym fragmentami DNA,
z którymi mogą utworzyć komplementarną stukturę. Po
hybrydyzacji filtr odpłukuję się z nadmiaru sondy i po
wysuszeniu poddaje autoradiografii. Widoczny na kliszy
układ prążków jest charakterystyczny dla użytej sondy
molekularnej i enzymu restrykcyjnego, którym cięto DNA.

Kliknij ikonę, aby
dodać obraz

Rozpoznanie

Aby rozpoznać dystrofię Duchenne`a należy

uwzględnić badania specjalistyczne takie jak:

1) badanie elektromiograficzne - Badanie

EMG (elektromiogram), u chorych z dystrofią

mięśniową typu Duchenne’a wykazuje typowe

cechy mięśniowe:

* małe, krótkie potencjały polifazowe,

* zaburzenia gradacji zapisu

wysiłkowego.

Badanie to nie może być jednak podstawą

rozpoznania.

Rozpoznanie

Więcej danych uzyskuje się na podstawie

badania wycinka mięśniowego pobranego
drogą biopsji z ramienia lub uda chorego.

Określa się charakter i nasilenie zmian

degeneracyjnych co umożliwia rozpoznanie
dystrofii mięśniowej.

Stwierdzenie braku dystrofiny potwierdza

podejrzenie dystrofii typu Duchenne’a.

Rozpoznanie – badania
biochemiczne



Najszerzej stosowane jest oznaczenie

poziomu enzymów mięśniowych (kinaza
kreatynowa, aldolaza) w surowicy krwi.



Wzrost ich u nosicielek jest, co prawda,

mniejszy niż u chorych, ale zwykle wyraźnie
przekracza normę. Ten test wypada dodatnio u
około 2/3 nosicielek.



Ujemny wynik testu nie wyklucza możliwości

nosicielstwa, ponieważ poziom badanych
enzymów może wykazać nawet dzienne
wahania u tej samej osoby.

Badanie nosicielstwa

Przy użyciu odpowiednich technik

laboratoryjnych możliwa jest identyfikacja
defektu w genie odpowiedzialnym za
produkcję dystrofiny.

Badanie to pozwala również na pewne

potwierdzenie (lub wykluczenie) choroby u
płodu.

>>> Wykorzystywane są wówczas komórki

pochodzące z płynu owodniowego pobranego
drogą amniopunkcji.

Leczenie



Pomimo zaawansowanych badań nad

skutecznym leczeniem dystrofii mięśniowych,
jak dotąd najbardziej sprawdzoną metodą
postępowania jest stosowanie wysokich
dawek leków sterydowych. Takie leczenie daje
niestety zaledwie krótkotrwałą poprawę stanu
pacjenta i powoduje wiele skutków ubocznych
(związanych ze sterydoterapią). Duże
znaczenie ma stosowanie diety bogatej w
białko oraz witaminy, a także stosowanie
odpowiedniej rehabilitacji, której celem jest
zapobieganie przykurczom mięśni. 

Literatura



Biologia molekularna w medycynie - J. Bal



Analiza DNA – teoria i praktyka – R. Słomski



www.biotechnolog.pl



www.genetyk.pl