IZOLACJA Z GLEBY:
Bezpośrednia:
pobieramy kilka próbek z różnych miejsc odległych od siebie o 5-6 metrów
indywidualne próby umieszczamy w pojemnikach oddychających
w laboratorium próby indywidualne łączymy w próbę zbiorczą
dokładnie mieszamy
izolacja jedną z następujących metod:
wykładanie drobiny gleby na pożywkę w centrum płytki Petriego
przemywanie próby gleby wodą i izolacja z zawiesiny komórkowej lub zarodnikowo-strzępkowej
rozcieńczanie próby gleby i izolacja z mieszaniny rozcieńczalnika (woda, 1% agar lub olej mineralny w stosunku 1:10) i gleby (sterylny piasek kwarcowy)
Pośrednia:
umieszczanie w glebie pułapek organicznych lub roślin pułapkowych
izolowanie z pułapek zasiedlających je mikroorganizmów
pułapki mogą być wprowadzane w rurkach szklanych lub metalowych z otworami bocznymi, przez które dochodzi do kolonizacji
stosujemy w przypadku prób organicznych
IZOLACJA Z ROŚLINY
pobieramy fragment rośliny z częścią chorą i zdrową
przepłukujemy
sterylizujemy 96% alkoholem
płuczemy w wodzie destylowanej
suszymy między warstwami wyjałowionej bibułki w ciepłym powietrzu
dzielimy na inocula
wykładamy na pożywkę
inkubacja 5-10 dni
wyhodowane kolonie przeszczepiamy na skosy
IZOLACJA Z POWIETRZA
Metoda sedymentacji Kocha - polega na wyeksponowaniu płytki Petriego z pożywką w środowisku, które chcemy zbadać. Drobnoustroje ze środowiska będą opadały na płytkę, a po odstawieniu do inkubacji wytworzą się kolonie. Minimalny czas ekspozycji to 10 min, maksymalny - 60 min. Czas ekspozycji zależy od zanieczyszczenia i intensywności ruchu powietrza.
CFU (colony forming units) - liczba kolonii na płytce w określonej ilości zawiesiny
CFU = liczba kolonii * stopień rozcieńczenia * objętość próbki
KOMORA THOMA - szklana płytka z 2 wgłębieniami (głębokość 0,1 mm) i naniesioną siatką podzieloną na 16 dużych kwadratów o powierzchni 1/400 mm2. Każdy z tych kwadratów składa się z 16 małych kwadracików o boku 0,05 mm i objętości pod szkiełkiem nakrywkowym 1/4000 mm3. Komora Thoma służy do bezpośredniego liczenia drobnoustrojów pod mikroskopem.
POŻYWKA - płynne lub zestalone mieszaniny odpowiednio dobranych składników służących do hodowli drobnoustrojów w warunkach sztucznych.
DOBRA POŻYWKA CHARAKTERYZUJE SIĘ:
odpowiednią wartością odżywczą
optymalnym odczynem
odpowiednim ciśnieniem osmotycznym
klarownością
sterylnością
POŻYWKA ZAWIERA:
węgiel (cukry proste i złożone)
azot (związki nieorganiczne i organiczne)
sole mineralne (siarczany, fosforany, chlorki żelaza, magnezu potasu, sodu i in.; właściwości buforujące i regulujące ciśnienie osmotyczne)
czynniki wzrostowe (syntetyczne lub naturalne witaminy)
składniki wybiórcze (antybiotyki, sole kwasów żółciowych, barwniki; tylko pożywki selektywne i specjalistyczne)
czynniki zestalające (agar, żelatyna, żel krzemionkowy, białka jaj, surowica krwi)
PODZIAŁ POŻYWEK ZE WZGLĘDU NA:
DOBÓR SKŁADNIKÓW ODŻYWCZYCH:
naturalne
półsyntetyczne
syntetyczne
ZAWARTOŚĆ SKŁADNIKÓW ODŻYWCZYCH:
podstawowe
wzbogacone
CEL:
namnażające
namnażajaco-wybiórcze
identyfikacyjne
KONSYSTENCJĘ:
płynne
półpłynne
stałe
PODŁOŻA:
hipotoniczne - o niższym ciśnieniu osmotycznym niż w komórkach drobnoustrojów (jest przyczyną pęcznienia i pękania komórek)
hipertoniczne - o wyższym ciśnieniu osmotycznym niż w komórkach drobnoustrojów (powoduje kurczenie się plazmy komórkowej i zjawisko plazmolizy)
izotoniczne - o właściwym ciśnieniu osmotycznym
PODŁOŻE CHAPMANA - pożywka wybiórczo różnicująca. Służy do izolacji gronkowca w warunkach beztlenowych. Elementem różnicującym jest manitol. W wyniku fermentacji manitolu i zakwaszenia środowiska pożywka zmienia kolor z różowego na żółty.
PODŁOŻE MACCONKEYA - pożywka wybiórczo-różnicująca. Elementem różnicującym jest laktoza. Kolor wyjściowy - bezbarwny. Różnicuje bakterie gram- na fermentujące laktozę i nie fermentujące laktozy. Bakterie fermentujące laktozę (Escherichia coli, Klebsiella) zakwaszają podłoże do pH<6,8. Dochodzi do zmiany barwy kolonii z bezbarwnych na czerwono-różowe.
BARWIENIE BAKTERII
umożliwia dokładniejszą obserwację kształtu i budowy drobnoustrojów
BARWNIKI:
fuksyna - zaznacza kontury komórek,
fiolet krystaliczny - zaznacza kontury barwionych komórek,
fiolet goryczkowy,
safranina,
zieleń malachitowa,
błękit metylenowy - różnicuje wewnętrzną strukturę komórek,
erytrozyna (barwnik kwaśny) - barwienie preparatów z gleby; uwidacznia plazmę komórek drobnoustrojów ale nie wybarwia gleby
BARWIENIE PROSTE - jeden barwnik; obserwacja kształtów
BARWIENIE ZŁOŻONE - dwa lub wiece barwników, różne sposoby odbarwiania i utrwalania preparatów; różnicuje komórki i ich struktury wewnętrzne
SPOSÓB PRZYGOTOWANIA PREPARATU DO BARWIENIA
Opalamy nad palnikiem szkiełko przedmiotowe i studzimy.
Nakładamy kroplę wody.
Umieszczamy odrobinę materiału hodowlanego w kropli wody.
Wykonujemy rozmaz na dużej powierzchni szkiełka.
Wysuszamy rozmaz na powietrzu.
METODA GRAMA
barwienie złożone
pozwala wyróżnić gramdodatnie (fioletowe) i gramujemne (czerwone)
polega na traktowaniu bakterii fioletem krystalicznym a następnie płynem Lugola i safraniną
fiolet krystaliczny wybarwia bakterie gram+ i gram-
płyn Lugola utrwala połączenie fioletu z gram+ (gram- odbarwiają się w alkoholu)
safranina zabarwia gram- na czerwono
SPOSÓB POSTĘPOWANIA:
Preparat utrwalamy przez trzykrotne przesunięcie nad płomieniem palnika.
Barwimy preparat roztworem fioletu krystalicznego.
Tryskawką delikatnie zmywamy barwnik.
Zalewamy preparat płynem Lugola.
Zlewamy płyn Lugola.
Spłukujemy preparat wodą.
Otrząsamy z wody i zalewamy roztworem safraniny.
Spłukujemy preparat wodą i osuszamy.
METODA SCHAFFERA-FULTONA
barwienie złożone
polega na traktowaniu bakterii zielenią malachitową i safraniną
barwienie przetrwalników (Bacillus i Clostridium)
przetrwalniki barwią się tylko na gorąco
zieleń malachitowa barwi protoplazmę przetrwalników na zielono
safranina wybarwia protoplazmę komórek wegetatywnych na czerwono
SPOSÓB POSTĘPOWANIA:
Preparat utrwalamy przez trzykrotne przesunięcie nad płomieniem palnika.
Studzimy utrwalony preparat.
Barwimy preparat roztworem zieleni malachitowej.
Nie zlewając barwnika, od spodu podgrzewamy preparat płomieniem palnika do trzykrotnego ukazania się pary.
Spłukujemy preparat wodą do chwili ustania wymywania barwnika.
Barwimy preparat roztworem safraniny.
Spłukujemy preparat wodą i osuszamy.
Glomeromycota - GRZYBY MIKORYZOWE
obligatoryjne symbionty
arbuskule w komórkach korzeni
grzybnia niepodzielna ścianami poprzecznymi
zarodniki (chlamydospory):
duże grubościenne
tworzą się wewnątrz lub na zewnątrz korzenia
pojedyncze, w skupieniach lub owocnikach
od setek do kilku tysięcy jąder
brak rozmnażania płciowego
Chytridiomycota - SKOCZKOWCE
ameboidalna, holokarpiczna, jednokomórkowa plecha bez rizoidów
rozmnażanie płciowe: gametogamia
zarodniki płciowe: diploidalne, przetrwalnikowe zygoty
zarodniki bezpłciowe: zoospory
zmiana fazy jądrowej: haploidalno-diploidalna
Zygomycota - SPRĘŻENIOWCE
Grzybnia pozbawiona ścian poprzecznych, wielojądrowa
Przegrody poprzeczne często w sporangioforach
Rozmnażanie płciowe na drodze gametangiogamii
Zarodniki płciowe - zygospory; bezpłciowe - sporangialne lub konidia; przetrwalnikowe - chlamydospory
Zmiana faz jądrowych: haploidalno-diploidalna lub haploidalno-dikariotyczno-diploidalna
Saprotrofy
Rozkładają wiele podłoży organicznych
Rosną i rozwijają się niezwykle szybko
Powszechne w glebie
Niektóre są kaprofilami
Część znalazła zastosowanie w przemyśle fermentacyjnym
Mogą być przyczyną dużych strat w przechowalnictwie płodów rolnych
Ascomycota - WORKOWCE
grzybnia komórkowa ze ścianami poprzecznymi
Rozmnażanie płciowe: gametangiogamia (rzadko somatogamia)
Zarodniki płciowe: zarodniki workowe w workach
Worki bezpośrednio w splotach grzybni lub w owocnikach (miseczka, otocznia zamknięta, otocznia otwarta, podkładka workowa)
Owocniki u workowców:
APOTHECIUM (MISECZKA) - wklęsłe wnętrze miseczki wyścielone jest hymenium
CLEISTOTHECIUM (OTOCZNIA ZAMKNIĘTA) - kulistego kształtu, z workami zamkniętymi wewnątrz owocnika.
PERITHECIUM (OTOCZNIA OTWARTA) - kształt kulisty z workami wewnątrz owocnika. Na jego powierzchni obecne są otwory, przez które wydostają się zarodniki
PSEUDOTHECIUM (PODKŁADKA WORKOWA) -podobny do perithecium jednak zarodniki nie tworzą regularnej warstwy zarodnionośnej, i są pokryte podwójną ścianą.
Zarodniki bezpłciowe: konidia
Zmiana faz jądrowych: haploidalno-dikariotyczno-diploidalna
Ok. 30% znanych gatunków grzybów patogenicznych i saprotroficznych
Basidiomycota - PODSTAWCZAKI
grzybnia komórkowa ze ścianami poprzecznymi
sprzążki (umożliwiają przemieszczanie się jąder potomnych przy podziale komórki)
Rozmnażanie płciowe: somatogamia
Zarodniki płciowe: zarodniki podstawkowe na podstawkach
Podstawki w owocnikach
Zarodniki bezpłciowe: oidia, konidia lub brak
Zmiana faz jądrowych: haploidalno-dikariotyczno-diploidalna
Długa dikariofaza
Ważne patogeny roślin i huby
Grzyby kapeluszowate, jadalne i niejadalne
Tworzą mikoryzy z roślinami (drzewami)
GRZYBY MITOSPOROWE
grzybnia komórkowa ze ścianami poprzecznymi
brak rozmnażania płciowego
zarodniki bezpłciowe: konidia; przetrwalnikowe: chlamydospory lub brak
brak zmian faz jądrowych
wszystkie stadia niedoskonałe grzybów i gatunki, u których nie jest znane stadium doskonałe
patogeny roślin
saprotrofy aktywnie rozkładające materię organiczna w glebie, wodzie, na roślinach
doprowadzają do dużych strat
wykorzystywane w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym
PLAZMOGAMIA - łączenie się plazmatycznej treści organów płciowych.
KARIOGAMIA - łączenie się jąder
OWOCNIKI - twory służące do rozrodu płciowego i wytwarzania zarodników, mające kształty kojarzące się z potocznym pojmowaniem wizerunku grzyba. Występują u podstawczaków i workowców.
ZARODNIKI - komórki lub zespoły komórek, które wyrastają w nowe osobniki po odłączeniu się od osobników macierzystych. Umożliwiają rozprzestrzenianie gatunku oraz przetrwanie niekorzystnych warunków.
SYMBIONTY OBLIGATORYJNE - grzyby tworzące mikoryzy arbuskularne z wieloma gatunkami roślin zielnych i drzew tropikalnych.
ANTHERIDIUM - haploidalny organ rozmnażania, w którym wytwarzane są plemniki.
SPRZĄŻKA - boczne uwypuklenie w miejscu występowania przegrody poprzecznej, umożliwiające przemieszczanie się jąder potomnych przy podziale komórki
PRZETRWALNIKI - formy spoczynkowe umożliwiające organizmom przetrwanie niekorzystnych dla nich warunków (Bacillus, Clostridium)
KOPROFAGI - organizmy odżywiające się odchodami innych organizmów
ZYGOSPORA - wielojądrowa struktura przetrwalnikowa wytwarzana u grzybów podczas gametangiogamii. Otoczona jest grubą ścianą komórkową.
ZOOSPORA - ruchliwe komórki rozrodcze (wegetatywne lub generatywne). Pływki zaopatrzone są w wici umożliwiające im poruszanie się w wodzie. Powstają w zarodniach zwanych zoosporangiami.
SPORANGIUM - organ rozmnażania bezpłciowego, wytwarzany głównie na sporoficie i tworzący zarodniki.
SUBSTANCJE ZESTALAJĄCE - służą do zestalania pożywki.
AGAR:
wielocukier otrzymywany z krasnorostów
pęcznieje w wodzie
temp. upłynniania: ok. 100oC
temp. zestalania: ok. 40-42oC
dodaje się 1,5-2%
niewykorzystywany przez bakterie
nieliczne gatunki mogą go rozkładać
ŻELATYNA
substancja białkowa otrzymywana w wyniku hydrolizy kolagenu
pęcznieje w wodzie
temp. upłynniania: ok. 30oC
temp. zestalania: ok. 20oC
dodaje się 12-15%
zużywana przez drobnoustroje zawierające enzymy proteolityczne
ogrzewana kilkakrotnie do 100oC traci właściwości zestalające
ANTYBIOTYKI - ograniczają rozwój bakterii, w tym chorobotwórczych.
ROZCIEŃCZANIE KOLONII
Do rozcieńczenia zawiesiny glebowej możemy użyć piasku kwarcowego (1g:50g-1g:2000g; dla gleb leśnych 1g:149g). 1g gleby delikatnie rozdrabniamy w moździerzu. Mieszamy z odrobina piasku i rozkruszamy gruzełki, następnie dosypujemy do reszty piasku i przez 3 minuty toczymy. Mikroczerpakiem pobieramy 27mm3 próbki, kładziemy do pustej płytki Petriego, dodajemy płynną pożywkę i otrzymujemy kolonie. Następnie przenosimy kolonie na skos.
Micrococcus - bakterie kuliste, tlenowe, liczne gatunki są ciepłooporne. Są one niepożądane w mleczarstwie, powodują też psucie się kwaszonek warzywnych. Niektóre biorą udział w dojrzewaniu serów.
Cladosporium - powodują mikozy, alergeny (produkują wiele związków lotnych), rozkładają skrobię, białka, pektyny, celulozę i hemicelulozę.
Bacillus - laseczki tlenowe, przetrwalnikujące. Mają właściwości gnilne. Niektóre są chorobotwórcze.
Alternaria - zarodniki wielokomórkowe o kształcie maczugowatym, szorstkie ściany komórkowe. Rozkładają białka, skrobię, pektyny, hemicelulozę i celulozę.
Penicylium - grzyby toksynotwórcze, kancerogenne. Gatunek można zidentyfikować na podstawie kształtu rozgałęzienia. Szorstkie ściany komórkowe.
Aspergilius - kropidlak, nabrzmienie na konidioforze, 2 piętra zarodników, zarodniki okrągłe, szorstkie, grubościenne.