A:AT (TAR) G:GC (TAR)

Rycina 6. (A) Trypleks antyrównoległy i stabilizujące go odwrotne wiązania Hoogsteena; (B) struktury kanoniczne trypletów antyrównoleglych A:AT i G: GC.

nie jest stabilny, a ich względna stabilność zależy silnie od warunków. Wynika stąd, że dla trypleksu równoległego wszystkie cztery pary zasad mogą potencjalnie tworzyć try-plety, jednak względna trwałość takich struktur różni się zna­cząco, szczególnie w przypadku par TA i CG. Istotna w tym kontekście jest możliwość utraty specyficzności rozpoznawa­nia wynikająca z faktu, że tymina (T) może rozpoznawać za­równo pary AT jak GC, podczas gdy cytozyna (C) rozpoznaje zarówno parę GC jak CG.

W przypadku trypleksu antyrównoległego, kanoniczne tryplety G:GC, A:AT i T:AT są znacznie bardziej stabilne niż tryplety niekanoniczne [19]. Jednak adenina (A) może tworzyć tryplet z parą GC natomiast tymina (T) wiąże się z parą CG. Jedynie para TA nie tworzy z innymi zasadami trwałego trypletu, co stanowi poważne ograniczenie two­rzenia się trypleksów antyrównoległych. Z drugiej strony zdolność tyminy do tworzenia trypletów zarówno z para­mi AT jak i CG oraz adeniny (A) do rozpoznawania par AT i GC powoduje obniżenie specyficzności tworzenia trypleksów antyrównoległych. Kanoniczne tryplety T:AT i C⁺:GC (TR) są izosteryczne w przeciwieństwie do trzech kanonicznych trypletów motywu antyrównoległego (A: AT, T:AT i G:GC), co może prowadzić do znaczących od­kształceń w przypadku struktur składająch się z różnych trypletów. Istotna różnica pomiędzy kanonicznymi tryple-tami w trypleksie równoległym (TR) oraz trypleksie anty-równoległym (TAR) wynika z faktu, że trypleksy równole­głe są izosteryczne, podczas gdy TAR nie są izosteryczne. Struktury trypleksowe są stabilizowane obecnością jonów metali: Mg²⁺, Ca²⁺, Zn²⁺, oraz poliamin (spermina, spermi-dyna, putrescyna), które neutralizują ujemny ładunek grup fosforanowych. Wykazano, że trypleks in vitro jest stabilny przy 5-10 mM stężeniu jonów Mg²⁺, podczas gdy w warun­kach in vivo konieczne stężenie wynosi prawdopodobnie mniej niż l mM [20]. Tworzenie trwałego trypleksu wyma­ga pełnej komplementarności zasad we wszystkich trzech łańcuchach, a pojedyncze niesparowane zasady powodują znaczącą destabilizację struktury.

W latach osiemdziesiątych Frank-Kamenetskii z zespo­łem wykazali, że wewnątrzcząsteczkowe struktury tryplek­sowe mogą się tworzyć w wyniku oddziaływań homopury-

Rycina 7. Wewnątrzcząsteczkowe zmiany konformacyjne prowadzące do po­wstania H-DNA i *H-DNA, stanowiących przykład równoległego i antyrówno-ległego ułożenia trzeciego fragmentu łańcucha. Nić homopirymidynowa ozna­czona kolorem szarym, nić homopurynowa - kolor czarny. Linie ciągłe oznaczają wiązania Watsona-Cricka, linie przerywane oznaczają wiązania (odwrotne) Ho-ogsteena.

nowo-homopirymidynowych powtórzeń lustrzanych (ang. mirror repeat secjuences) w ujemnie splecionych plazmidach [21], co stanowiło przełom w poszukiwaniach dowodów na istnienie trypleksów in vivo i poznaniu ich funkcji biologicz­nych. Autorzy ci wskazali również na specjalne znaczenie takich struktur dla aktywności nukleazy 51. Ponieważ wie­le spośród zidentyfikowanych dotąd traktów purynowo-pirymidynowych występuje w postaci powtórzeń lustrza­nych, stanowi to poważną przesłankę istnienia trypleksów in vivo. Struktury takie, określane jako H-DNA, tworzą się, gdy jedna część sekwencji lustrzanej dysocjuje na oddzielne pojedyncze łańcuchy purynowy i pirymidynowy, po czym następuje ponowne przyłączenie łańcucha homopirymidy-nowego do pozostałej połowy sekwencji dupleksu sekwen­cji mieszanej i utworzenie w bruździe większej struktury o charakterze trypleksu równoległego (Ryć. 7). Pozostała część pojedynczej nici homopurynowej odpowiada za czu­łość nukleazy Sl.

Możliwa jest również sytuacja, kiedy nić homopurynowa asocjuje ponownie tworząc trypleks antyrównoległy (*H-DNA). Struktury H-DNA zostały opisane szczegółowo w wielu monografiach i pracach przeglądowych [22]. Obec­ność kationów dwuwartościowych powoduje preferencyj­ne utworzenie *H-DNA (antyrównoległe) w stosunku do H-DNA. Hipoteza o występowaniu struktur H-DNA i *H-DNA w żywych organizmach została potwierdzona między innymi badaniami genu promotorowego hsp26 muszki owo­cówki (Drosophila melanogaster), w którym wykazano zna­czenie segmentu purynowo-pirymidynowego (CT)_n'(GA)_n dla prawidłowego tworzenia struktury chromatyny i akty­wacji genu, przeprowadzając eksperymenty z serią transge-nów hsp26-lacZ o zmienionej sekwencji [23]. Wykazano, że obecność sekwencji lustrzanej w regionie homopurynowo-homopirymidynowym, warunkująca utworzenie struktury H-DNA nie jest wystarczającym czynnikiem regulacji genu hsp26 w sytuacji, gdy regiony wiązania czynnika GAGA zo­stały usunięte.

Konieczność protonowania N³ cytozyny w trzecim łań­cuchu trypleksu równoległego wskazuje na ograniczoność występowania trypleksów równoległych w pH neutralnym, stabilne są natomiast trypleksy, w których cytozyny trzecie­go łańcucha zastąpione są naturalnie występującą 5-mety-locytozyną (^m5C). Stabilizującym czynnikiem w warunkach neutralnego pH może być również wzrost ujemnej superhe-likalnej gęstości [24].

73?

---