PRZEMYSŁ MLECZARSKI

Ćwiczenie 4

Temat:

Produkcja kwasu mlekowego przez bakterie fermentacji mlekowej. Część 1 - przygotowanie kultury wyjściowej, charakterystyka bakterii kwasu mlekowego.

Zagadnienia teoretyczne:

• charakterystyka bakterii z rodziny Lactobacteriaceae

• różnice pomiędzy homo- a heterofermentacją mlekową

• fermentacja prowadzona przez Bifidobacterium

• zastosowanie bakterii fermentacji mlekowej w biotechnologii z uwzględnieniem przetwórstwa warzywnego

Część praktyczna:

Materiały:

• liofilizowane kultury bakterii z rodziny Lactobacteriaceae

• podłoże wzrostowe dla liofilizowanych kultur bakterii z rodziny Lactobacteriaceae

• probówki z podłożem Ejkmana

• sterylne pipety 5 ml, 10 ml

• szkiełka podstawowe

• odczynniki do barwienia Grama

• próbki: zalewa z ogórków kiszonych, sok z kiszonej kapusty, jogurt z żywymi kulturami bakterii

• papierki lakmusowe

Zaszczepienie kultury wyjściowej:

• z kultury wyjściowej bakterii z rodziny Lactobacteriaceae (przygotowanej przez prowadzących), dodać po 10 ml do butelek zawierających 50 ml podłoża wzrostowego.

• inkubować bez wytrząsania w temperaturze 25^oC przez 7 dni.

Posiew na podłoże Ejkmana:

• pozwala na określenie typu fermentacji prowadzonej przez bakterie z rodziny Lactobacteriaceae

• niewielką ilością liofilizowanej kultury bakterii z rodziny Lactobacteriaceae zaszczepić podłoże Ejkmana

• inkubować 24-48 godzin

• żółta barwa pożywki i pęcherzyki gazu w rurkach Durhama świadczą o procesie heterofermentacji.

Obserwacja mikroskopowa bakterii kwasu mlekowego:

• przy pomocy papierków lakmusowych zmierzyć pH próbek: zalewa z ogórków kiszonych,
  sok z kiszonej kapusty, jogurt.

• z soku kapusty kwaszonej, zalewy z ogórków i jogurtu wykonać preparat barwiony metodą Grama. Na podstawie obrazu mikroskopowego i pH ocenić jakość kiszonki.

• kryteria oceny mikrobiologicznej kiszonek

Kiszonka bardzo dobra:

pH 3,5

Kiszonka dobra:

pH 4,5

wyższe pH - kiszonka złej jakości.

LITERATURA ŹRÓDŁOWA:

1. CHMIEL A.: „Biotechnologia - podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne” - Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 1998

2. RÓŻALSKI A.: „Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej” - Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego, Łódź, 1996

3. SCHLEGEL G. H.: „Mikrobiologia ogólna” - Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003

4. Źródła internetowe

Charakterystyka bakterii z rodziny Lactobacteriaceae:

- zdolne do fermentacji węglowodanów z wytworzeniem kwasu mlekowego
- zdolne do rozkładania laktozy dzięki wytwarzaniu enzymu β-galaktozydazy

- zróżnicowana morfologia (ziarniaki, laseczki)

- gramdodatnie
- nie wytwarzają endospor (przetrwalników)
- katalazoujemne
- beztlenowe, względnie beztlenowe
- nieruchliwe
- tolerują niskie pH
- bardzo wymagające pokarmowo
- naturalne środowisko: produkty mleczne, zdrowe i gnijące rośliny, układ pokarmowy i błony śluzowe

- Lactococcus sp., Leuconostoc sp., Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp.

Lactococcus:

- homofermentatywne

Leuconostoc:

- heterofermentatywne

Lactobacillus:

- b. probiotyczne
- tworzy florę jelitową
- homo i heterofermentatywne

Fermentacja prowadzona przez Bifidobacterium

Specyficzny rodzaj heterofermentacji mlekowej przeprowadzają bifidobakterie - jest to szlak fosfoketolazy pentozowej. Ten odrębny szlak jest wynikiem obecności u bifidobakterii specyficznych enzymów zastępujących kluczowe enzymy odpowiedzialne za przeprowadzanie typowej fermentacji mlekowej. Sumaryczny schemat heterofermentacji typu Bifidobacterium przedstawia się następująco:

2 C6H12O6 → 2 CH3-CHOH-COOH + 3 CH3COOH
glukoza kwas mlekowy kwas octowy

Zastosowanie bakterii fermentacji mlekowej w biotechnologii

- produkcja przetworów owocowych i warzywnych (ogórki konserwowe, dodatek do ogórków kiszonych, papryka konserwowa, pieczarki i warzywa marynowane, mizerie, sałatki warzywne, dżemy, marmolady), - produkcja przetworów rybnych,
- produkcja napojów (poprawa smaku, uwydatnienie naturalnego aromatu owocowego, właściwości konserwujące - stosowany jako zamiennik kwasu benzoesowego i askorbowego),
- piwowarstwo, winiarstwo,
- piekarnictwo (do korygowania kwasowości ciasta),
- mleczarstwo (do korygowania kwasowości mleka przy wyrobie serów, do zakwaszania śmietany),
- produkcja przetworów mięsnych.

- w rolnictwie kwas mlekowy używany jest w żywieniu trzody chlewnej, drobiu, w przygotowaniu kiszonek paszowych oraz w lecznictwie zwierząt
-

Homofermentacja mlekowa
- powstaje czysty bądź prawie czysty (90%) mleczan

Heterofermentacja mlekowa (szlak fosfoketolazy pentozowej)
- powstają: mleczan, etanol, CO2, octan

Liofilizacja - suszenie sublimacyjne zamrożonych substancji. W metodzie tej rozpuszczalnik jest usuwany w obniżonej temperaturze i pod zmniejszonym ciśnieniem. Umożliwia suszenie produktów termolabilnych (nieodpornych na ogrzewanie).

Posiewów dokonuje się na podłoże laktozowe z purpurą bromokrezolową (podłoże Eijkmana), a następnie inkubuje w temp. 37°C przez 24 lub 48 godzin. Za wynik dodatni przyjmuje się obecność gazu w próbówce Durhama, zmętnienie pożywki i zmianę jej barwy z fioletowej na żółtą. Jeśli po 24 godzinach powyższe zmiany nie wystąpią, wówczas próbki inkubuje się dalej i ponownie odczytuje po 48 h. Pojawienie się bardzo małej ilości gazu, przy jednoczesnym bardzo słabym zakwaszeniu lub braku zakwaszenia, uważa się za wynik wątpliwy. Hodowle, których wyniki po 24 godzinach inkubacji uznano za wątpliwe, poddaje się badaniu potwierdzającemu, a następnie inkubuje dalej do 48 h. W przypadku wątpliwości wykonuje się posiew na podłoże Endo oraz próby biochemiczne np. na wytwarzanie indolu.

---