15.04.2012

Wykład 17

Ogólne zasady optymalizacji i standaryzacji oznaczeń enzymatycznych

Klasyfikacja wg Enzyme Commission

nr o strukturze XX.XX.XX.XX

• EC

• nr klasy

1. oksydoreduktazy

2. transferazy

3. hydrolazy

4. liazy

5. izomerazy

6. ligazy

nr podklasy

nr podpodklasy

nr kolejny enzymu w podpodklasie

Enzymy są wykorzystywane w diagnostyce:

• oznaczenia substratowe (np. glukoza metodą oksydazową)

• oznaczenia enzymu (stężenie, aktywność)

Oznaczenia substratowe - to zazwyczaj dwufazowy ciąg reakcji enzymatycznych pozwalających na określenie stężenia danego substratu. Pierwszą reakcję katalizuje „właściwy” enzym, następnie dokonuje się pomiaru właściwości fizycznych lub chemicznych jednego z produktów lub dochodzi do cyklu reakcji enzymatycznych.

Metoda, w której przekształcenie substratu oznaczanego jest całkowite nazywa się metodą produktu końcowego. W innym przypadku wykonuje się krzywe wzorcowe, kalibracyjne.

Oznaczenia enzymatyczne - to takie, w których definiuje się enzym pośrednio przez zmianę stężenia substratu lub produktu:

• możliwość oznaczenia bardzo małych ilości białek z odpowiednią czułością i swoistością analityczną

• stosunkowo niskie koszty i mało czasochłonne procedury

• całkowite uzależnienie wyniku od warunków procesu pomiarowego

• nie ma metod definitywnych, trudno ustalić zakresy wartości prawidłowych (względny zakres wartości referencyjnych)

• konieczność optymalizacji warunków reakcji we współgraniu z maksymalną wiarygodnością (metody referencyjne)

• jednolity wzorzec postępowania.

Czynniki wpływające na aktywność enzymu

1. Temperatura (37^oC - średnia temperatura ciała człowieka)

2. Bufory i pH

• bufor, ulegając deaktywacji, może hamować reakcję

• w zależności od temperatury zmienia się pH reakcji

np. fosfataza alkaliczna

• 25^oC pH 10,3

• 30^oC pH 10,1

• 37^oC pH 9,9

3. Substraty - zapewnić należy takie warunki, bo nie cała ilość substratu była wykorzystana w jednostce czasu (substrat w nadmiarze)

4. Efektory - efektor dodatni (aktywator), z reguły aktywuje enzym oznaczamy; efektor ujemny (inhibitor), z reguły hamuje aktywność enzymów nie podlegających oznaczeniu

5. Frakcja objętości próbki

• aktywność enzymu jest ściśle zależna od proporcji pomiędzy badaną próbką a odczynnikiem; zbyt wysokie lub zbyt niskie stężenie substancji dodatkowych wpływa na stabilność białka enzymatycznego (wydłużają lub skracają okres półtrwania)

• efekt Hooka, charakteryzuje się uzyskaniem niskich wartości aktywności/stężenia, podczas gdy w rzeczywistości są one ekstremalnie wysokie

• rozcieńczając próbkę rozcieńcza się również aktywatory i inhibitory enzymów!!

Efekt matrix (nie wyeliminujemy nigdy) - wpływ tła na oznaczanie (płyny, odczynniki, aparat). Efekt matrix można zmniejszyć do minimum (np. wykonując oznaczenia względem próby ślepej), lecz nie można go wyeliminować.

Czułość i swoistość

Czułość rewelacyjna, nawet >90%, oznaczenia enzymatyczne mają tendencję do bycia prawdziwie ujemnymi, co przekłada się na duże prawdopodobieństwo wykluczenia choroby.

Swoistość jest niska, gdyż enzymy występują powszechnie w komórkach wszystkich tkanek, co przekłada się na stosunkowo duży odsetek wyników fałszywie dodatnich.

Różnice w uwalnianiu enzymów do krążenia zależą od:

• ukrwienia narządu

• unaczynienia limfatycznego

• lokalizacji enzymu w kompartymentach komórki

• budowy enzymu.

Kryteria jakości w chemii klinicznej: IFCC - Międzynarodowa Federacja Chemii Klinicznej

Jak zwiększyć swoistość oznaczeń enzymatycznych

• oznaczenia enzymów swoistych narządowo (GLDH, OCT)

• definiowanie panelu narządowego kilku enzymów oznaczanych jednocześnie

• wyznaczanie wskaźników (de Ritisa AspAT/AlAT)

• oznaczanie izoenzymów lub lizoform (CK_MB­)

Wspólne zasady w metodyce

1. Warunki pomiaru dobierane w taki sposób, by odczytu dokonywać w zakresie prostoliniowym zależności szybkości reakcji od stężenia substratu. Substrat powinien być w nadmiarze w stosunku do enzymu.

2. W metodzie kinetycznej ocenia się pośrednią aktywność enzymu dokonując obserwacji niskiego stężenia substratu lub wysokiego stężenia produktu w jednostce czasu, w określonych warunkach, w stałej temperaturze. Szybkość reakcji enzymatycznej jest miarą aktywności enzymu.

3. Metody enzymatyczne nie są metodami definitywnymi. Każdy wynik należy odnieść do warunków przeprowadzonej reakcji.

4. Test optyczny

Różne widma absorpcji nukleotydu NAD w zależności od formy:

260 nm - maksimum dla NAD, NADH₂

340 nm - maksimum dla NADH₂

W przypadku zastosowania lampy rtęciowej absorpcję mierzy się przy długości fali 334 i 366 nm.

5. Jednostka aktywności enzymu- wycofano się z metod dwupunktowych, tzw statystycznych, w których odczytu ekstynkcji dokonano w momencie zerowym, po upływie określonego czasu.

Test optyczny- różnica widma absorpcji NAD.

260Nm - max dla NAD, NADH2

340nm- max da NAD

Jednostka międzynarodowa, to taka aktywność enzymu, która w ciągu 1 minuty powoduje przemianę 1 μmola substratu i powstanie 1 μmola produktu.

AMINOTRANSFERAZA ASPARAGINIANOWA EC.2.6.1.1.

• powszechna w większości tkanek zwierzęcych, roślinnych i mikroorganizmów

• izoenzymy

• mitochondrialny m-AspAT - nierozpuszczalny ruchliwość katodowa

• cytoplazmatyczny c-AspAT - rozpuszalny, ruchliwość anodowa

• mają odmienną wrażliwość na pH (m-AspAT - bardzo kwaśne środowisko), ich koenzymem potrzebnym do aktywności katalitycznej jest obudowany w cząsteczkę fosforan pirydoksalu

Metoda oznaczenia - metoda Karmena, z wykorzystaniem testu optycznego

AspAT

L-asparaginian + α-ketoglutaran ↔ L-glutaminian + szczawiooctan

MDH

szczawiooctan+ NADH + H⁺ ↔ L-jabłczan + NAD⁺

• enzymy pomocnicze

• MDH - dehydrogenaza jabłczanowa - eliminuje ze środowiska reakcji szczawiooctan (inhibitor AspAT)

• LDH - eliminuje ze środowiska reakcji pirogronian (w wysokim stężeniu hamuje tworzenie szczawiooctanu, destabilizuje oznaczenie)

• koenzym

• fosforan pirydoksalu (aktywna forma witaminy B₆) wiąże się z AspAT podczas 7 minut preinkubacji; nie wpływa na trwałość enzymu, lecz zmienia jego aktywność (wysoka szybkość reakcji - 50% AspAT wątrobowa, 15% AspAT sercowa)

• bufor TRIS

• Optymalne pH 7,8 (7,6-8,0) wyzwala ok.95% aktywności enzymu. Bufor fosforanowy hamuje połączenie koenzymu z enzymem.

AMINOTRANSFERAZA ALANINOWA EC.2.6.1.2.

• występuje powszechnie w świecie zwierząt, roślin i mikroorganizmów

• izoenzymy

• mitochondrialny m-AlAT powinowactwo do pirogronianu

• cytoplazmatyczny c-AlAT powinowactwo do cytrynianu

Metoda oznaczania

AlAT

L-alanina + α-ketoglutaran ↔ L-glutaminian + pirogronian

LDH

pirogronian + NADH + H⁺ ↔ L-mleczan + NAD⁺

• LDH wykorzystywany jest jako właściwy enzym (nie pomocniczy)

• jako konkurentów LDH, nie powinno być domieszek GLDH (produkuje NAD⁺ fałszywie wysoki wynik)

• koenzym fosforan pirydoksalu zwiększa aktywność AlAT o 20%

• bufor TRIS, optymalne pH 7,3

• dodatek glicerolu eliminuje jony amonowe, które zmieniają aktywność AlAT

KINAZA KERATYNOWA (CK) EC.2.7.3.2.

Wytwarzana przez różne typy tkanek, najwięcej przez mięśnie szkieletowe, mniej przez mięsień sercowy i tkankę mózgową. Najmniej jest jej w nerkach, nie występuje w wątrobie i erytrocytach., Wątrobowa kinaza adenylowa (AK) konkuruje o ten sam substrat!!

Izoenzymy

• mięśniowy CK-MM (2 podjednostki M)

• sercowy CK-MB (jedna podjednostka M, jedna B)

• mózgowy CK-BB (2 podjednostki B)

Nie przedostaje się do moczu. Każda z podjednostek zawiera jedno miejsce katalityczne oraz jedną grupę -SH warunkujące zdolność katalityczną enzymu. Utlenienie do S-S hamuje aktywność enzymu. Całkowita CK jest mieszaniną izoenzymów, co w metodyce utrudnia dobór warunków optymalnych dla przebiegu reakcji.

Metoda oznaczenia

CK

kreatynofosforan + ADP ↔ kreatyna + ATP

HK

ATP + D-glukoza ↔ ADP + D-G-6-fosforan

G6PDH

G-6-F + NDP ↔ D-glukuronian -6

• enzymy pomocnicze: Heksokinaza i dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa

• warunki optymalne: pH 6,5 dla 37^oC - optymalna szybkość tworzenia ATP w pierwszym etapie oraz optymalny udział izoenzymów CK oraz aktywność enzymów pomocniczych

• bufor: octan imidazolu w stężeniu 100 nmol/l optymalnym dla nośności buforu i najmniejszego hamowania kinazy przez aniony buforu

• efektory:

1. jony Mg²⁺ - aktywują CK i HK

jony Ca²⁺ - konkurują z Mg²⁺ oraz Fe³⁺ i Cu²⁺ (działanie hamujące)

jony I^-, SO₄^2-, NO₂^-, Br^-, SO₃^2-, Cl^-, F^- - inhibitory niekompetycyjne, obecne w materiale badanym oraz uwalniane przez bufory I dodatkowe związki tiolowe

2. NAC - stabilizuje grupę SH zapobiegając ich utlenieniu

3. EDTA - stabilizuje NAC chroniąc przed autooksydacją, wiąże Ca²⁺ i Fe³⁺

4. ADP - substrat dla CK oraz AK katalizuje

5. pentofosforan dwuadenozyny - inhibitor AK erytrocytarnej i mięśniowej

Formy CK

Izoenzymy (formy dimeryczne, cytoplazmatyczna)

CKBB - mózg- 100%, ślad w prostacie, jelitach, płucach, pęcherzu moczowym, macicy, tarczycy, łożysku

CKMB - serce 15-50% w sercu, w mm szkieletowych

CKMM - mięśnie i serce 98% w mięśniach szkieletowych, w sercu 50-60%

Izoformy

CK-MM­₃, CK-MM₂, CK-MM₁, CK-MB₂, CK-MB₁

Makroformy

Typ 1 - makroCK - kompleks CKBB - Ig (u 3% populacji często u kobiet po menopauzie, do 100% aktywności CK)

Typ 2 - makroCK - oligomer CKMiMi (1-2% populacji związany z nowotworami), aktywność rośnie w miarę kacheksji.

Formy oktameryczne sMt-CK - mitochondrialna forma mięśniowa

UMt-CK- mitochondrialna wszędobylska

Metoda oznaczenia

1. Metoda immunoinhibicji w oznaczaniu aktywności CKMB. Polega na blokowaniu podjednostki M przy pomocy przeciwciał monoklonalnych, a następnie oznaczaniu aktywności CK i podwajaniu uzyskanego wyniku. O zawale stanowi aktywność CKMB w ilości 6-25% CK!!!

2. Metoda immunologicznego oznaczania masy CKMB_mass­ - obecnie rekomendowany marker wczesny zawału mięśnia sercowego. Technika kanapkowa z końcowym odczytem fluorescencyjnym ELFA.

3. Elektroforeza

4. Izoformy - elektroforeza wysokonapięciowa na chłodnym żelu, ogniskowane izoelektrycznie, chromatografia cienkowarstwowa

DEHYDROGENAZA MLECZANOWA EC.1.1.1.27.

(Czy dochodzi do ↑ obrotu komórkowego np. w nowotworze?)

Występuje powszechnie w tkankach ludzkich:
nerki > serce > mięśnie poprzecznie prążkowane > trzustka > śledziona > wątroba > płuca > łożysko > erytrocyty, trombocyty, leukocyty

Bada się w surowicy i płynach z jam ciała (różnicowanie przesięków od wysięków), dawniej w diagnostyce późno zawałowej.

Tetramer zbudowany z podjednostek M i H, różniących się odpowiedzią na substratą i ruchliwością elektroforetyczną. Największy diagnozowany enzym masa cząsteczkowa 134 kDa. Enzym typowo cytoplazmatyczny o bardzo niskiej swoistości narządowej.

Izoenzymy

LDH₁ H₄

LDH₂ H₃M₁

LDH₃ H₂M₂

LDH₄ H₁M₃

LDH₅ M₄

LDH-X, LDH-C

LDH₆

Metoda oznaczania

LDH

pirogronian + NADPH + H⁺ ↔ L(+)-mleczan + NAD⁺

Równowaga reakcji metodycznej przesunięta jest w stronę wytwarzania mleczanu.

Szybkość reakcji 3x większa i zapewnia lepszą stabilność odczynników. Podjednostki M i H różnią się właściwościami katalitycznymi, podjednostki M potrzebują dużo więcej pirogronianu.

Efektory

• jony Na⁺ Cl^- - ułatwiają optymalizację metody przez minimalizację różnic między izoenzymami

• inhibitory powstają podczas przechowywania NADPH rozpuszczonego w buforze fosforanowym (obecnie się rezygnuje z tego)

Bufor:

TRIS/NADH, pH 7,2, stabilność 5 dni w temp. 4st; w metodzie UV bufory: AMP, DEA.

γ- GLUTAMYLOTRANSFERAZA EC.2.3.2.2.

Bardzo rozpowszechniony enzym błonowy, w największych ilościach w wątrobie, przewodach żółciowych i nerkach a także trzustce i prostacie. Jest dimerem, podjednostki różnią się sekwencją 40 aminokwasów, dzięki którym enzym jest zakotwiczony w błonie. Bierze udział w przemianach glutationu, jednak nie wykorzystuje się tego substratu w oznaczaniu.

Substraty syntetyczne

1. L-γ-glutamylo-3-karboksy-4-nitroanilid

L-γ-glutamylo-3-sulfonylo-4-nitroanilid

L-γ-glutamylo-4-nitroanilid

akceptory grupy glutamylowej

2. glicyloglicyna, L-cystyna, L-metionyloglicyna, L-glutamyloglicyna, L-alanyloglicyna

Akceptory grupy glutamylowej: glicyloglicyna daje najwyższą aktywność enzymu, dobrze rozpuszczalna i tania. W miarę starzenia się odczynnika uwalnia glicynę, która jest inhibitorem

Metoda oznaczenia

G6TP

L γ glutamylo-4nitroanilid + glicynoglicyna ↔ γ glutamyloglicyna + 3-karboksy-4-nitroanilina

Częściowo tło substratu (max 330 nm) nachodzi na maksimum absorpcji dla nitroaniliny (max 380 nm), dlatego odczytu dokonuje się < maksimum produktu - 410 nm.

FOSFATAZA ALKALICZNA (ALP) EC.3.1.3.1.

Pospolity enzym: śluzówka jelita > łożysko > nerki > kości > wątroba > płuca. Dimer zawierający 2 atomy cynku, z których jeden odpowiada za integralność, drugi za aktywność katalityczną.

Izoenzymy

• wątrobowy (ostre WZW, marskość, nowotwór)

• kostny (osteoporoza, osteomalacja, wzrost)

• trzustkowy (OZT, nowotwór, zwłóknienie trzustki, cysty)

• jelitowy (owrzodzenia dwunastnicy, zapalenie jelita grubego)

• łożyskowy (cholestaza łożyskowa, trzeci trymestr ciąży)

• nowotworowy (podobny do łożyskowego)

Są również patologiczne izoenzymy nowotworowe. Izolowany wzrost aktywności ALP jest zawsze niepokojący, wykluczając wzrost i ciążę.

Metoda oznaczania

ALP

4-nitrofenylofosforan sodu + H2O ↔ 4-nitrofenol + fosforan sodu

1. Bufor: dimetyloamina DEA początkowo wodorowęglanowy

AMP N-metylo-glutamina

2. Efektory:

• aktywatory: octan magnezu, siarczan cynku - dobry wpływ na efekt allosteryczny

• inhibitory: EDTA, aminokwasy (fenyloalanina oraz homocysteina)

• Optymalne pH 10,3-10,5

TABELKA WAŻNA!!!

Izoenzym	Żółciowy	Wątrobowy	Kostny	Łożyskowy (podobny do nowotworowego)	Jelitowy
Termolabilność	chwiejny	chwiejny	bardzo chwiejny	stabilny	chwiejny
Hamowanie: L-fenyloalanina	słabe	słabe	słabe	silne	silne
L-homocysteina	zmienne	silne	silne	słabe	słabe
L-leucyna	słabe	zmienne	zmienne	słabe	słabe
Inaktywacja mocznikiem	silna	silna	bardzo silna	słaba	zmienna
Ruchliwość elektroforetyczna	α1	α2	α2	α/β	β

AMYLAZA EC.3.2.2.1.

Hydrolizuje wiązanie 1,4-glikozydowe glikogenu i skrobi, zaczynając proces trawienia cukrów. Trzy rodzaje: α, β i γ. U człowieka: α i γ. 8 izoenzymów: z trzustki, błony śluzowej jelita cienkiego, gruczołów ślinowych i mlecznych, komórek gonad oraz tarczycy.

Przedostaje się do moczu (masa cząsteczkowa 50 kDa), w 50% jest reabsorbowana w kanalikach (lipaza w 100%) i tam utrzymuje się dłużej niż w surowicy. Izoenzymy mają w centrum katalitycznym grupę tiolową stabilizowaną Ca²⁺.

Makroamylazemia - towarzyszy myeloma, lymphoma, AIDS, nie filtruje się w nekach. Heterogenny strukturalnie kompleks z Ig, często dodatkowo z α₁antytrypsyną lub kompleks nie filtruje się w nerkach! Utrzymuje się w krwi latami.

Pseudomakroamylazemia- kompleks powstały w efekcie dożylnego podania dekstranu

Metoda oznaczania

α amylaza

maltotetrioza + H2O ↔ 2 maltoza

MP

maltoza + Pi ↔ β-glukozo-1-fosforan

Enzymy pomocnicze:

• MP - fosfataza maltozy

• βPGM - β-fosfoglukomutaza

• G6PDH - dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa

Efektory:

CaCl₂, aktywuje enzym

Optymalne pH 6,6

klirens amylazy aktywność amylazy w surowicy kreatynina surowica

------------------- = ----------------------------------------- x ---------------------------- x100%

klirens kreatyniny aktywność amylazy w moczu kreatynina mocz

Prawidłowo: 1-4%

Makroamylazemia: <1%

OZT: 7-10%

---