Kultury in vitro roślin

• 1. Wprowadzenie do kultur in vitro

• 2. Pożywka i jej składniki

• 3. Autoklawowanie pożywki

• 4. Materiał roślinny, jego zakażenia i sterylizacja.

• 5. Rodzaje kultur in vitro

• 6. Kultury tkankowe różnych roślin

• 7. Wyposażenie laboratorium kultur in vitro.

• 8. Organogeneza w kulturach in vitro.

• 9. Rośliny transgeniczne

Najczęściej stosowane pojęcia

• eksplantat (ang. explant) - część rośliny (zwykle drobna) przeniesiona na sztuczną pożywkę dla zapoczątkowania hodowli in vitro

• inokulum [łac.], roln. zawiesina cząstek wirusa, komórek bakterii lub zarodników grzyba (czasem fragmentów strzępek) patogenicznych dla rośliny, przygotowana przez człowieka w celu dokonania sztucznego zakażenia rośliny (inokulacja).

• klon (ang. clone) - 1. zbiór organizmów lub cząsteczek będących wiernymi kopiami ich pierwowzoru (rodzica, matrycy); 2. osobnik powstały w wyniku rozmnażania wegetatywnego jakiegoś organizmu, będący jego wierną genetyczną kopią

• klonowanie (ang. cloning) - wytwarzanie identycznych produktów (DNA, genów, komórek, organizmów); powielanie; masowe rozmnażanie wegetatywne roślin

• organogeneza (ang. organogenesis) - tworzenie się organów "od nowa", tj. w tkankach, które w chwili zakładania hodowli nie zawierały zawiązków tych organów; zasadnicze rodzaje: o. pędowa i korzeniowa (ryzogeneza)

• pasaż (ang. passage) - przeszczepienie hodowli organów, tkanek lub komórek, w całości lub jej części, na nową pożywkę

Najczęściej stosowane pojęcia

• ryzogeneza (ang. rhizogenesis) - organogeneza korzeniowa; powstawanie korzeni "od nowa", tj. w tkankach które w momencie zakładania hodowli nie zawierały zawiązków korzeni

• sterylny (ang. sterile) - bez istot żywych, zwłaszcza drobnoustrojów (np. o pożywce, narzędziach, naczyniach itp.) niezdolny do tworzenia sprawnych (skutecznych) gamet

• totipotencja (ang. totipotency; ) - zdolność komórki organizmu do tworzenia wszystkich typów komórek występujących w dojrzałym organizmie; zdolność pojedynczej komórki wielokomórkowego organizmu do wytworzenia całego organizmu

• uorganizowany (synonim: zorganizowany; ang. organized, porównaj: organize) - tworzący struktury o charakterystycznej, uporządkowanej budowie (pod względem kształtu i układu tkanek)
  
  
  
  
  
  

Wprowadzenie

• Wzrost i rozwój.

• Wzrost rośliny - nieodwracalny proces powiększania rozmiarów określonego organu lub całej rośliny związany ze zwiększaniem się wielkości komórek, ich liczby oraz z przyrostem masy protoplastu i ścian komórkowych.

• Wzrost jest procesem ilościowym i zachodzi dzięki aktywności merystemów:

• wierzchołkowych

• bocznych

• interkalarnych

Wprowadzenie

• Wzrost

• Wyróżnia się wzrost:

• embrionalny - powiększanie się rozmiarów organu wskutek zwiększania się liczby komórek

• elongacyjny - wzrost organu na skutek powiększania się rozmiarów komórek

• związany z różnicowaniem się komórek - przyrost masy organu wskutek rozbudowy ścian komórkowych

• Wzrost roślin podobnie jak jej rozwój jest procesem kontrolowanym przez czynniki:

• wewnętrzne - uwarunkowania genetyczne, fitohormony

• zewnętrzne - promieniowanie świetlne, temperatura, wilgotność, składniki mineralne, ilość dwutlenku węgla i tlenu, czynniki stresowe.

Wprowadzenie

• Rozwój rośliny - ogół przemian jakościowych zachodzących w ciągu ontogenezy rośliny. Rozwój rośliny jest ściśle powiązany z jej wzrostem, te dwa procesy zachodzą równocześnie i nie można ich od siebie oddzielić, dlatego też często mówi się o procesach wzrostu i rozwoju roślin łącznie.

• Wyróżnia się wzrost i rozwój:

• wegetatywny - dochodzi podczas niego do stopniowego wykształcenia się różnych tkanek i organów wegetatywnych

• generatywny - jest związany z wykształcaniem się zawiązków kwiatowych, pąków kwiatowych, kwiatów, owoców i nasion.

Wprowadzenie

• Wzrost i rozwój w warunkach in vivo są to procesy zachodzące pod działaniem wymienionych wcześniej warunków wewnętrznych jak i zewnętrznych

• Wzrost i rozwój w warunkach in vitro są to procesy zachodzące na sztucznych pożywkach w warunkach kontrolowanych (in vitro - w szkle).

Definicja kultur in vitro

• Definicja kultur tkankowch.

• Kultury organów, tkanek i komórek roślinnych in vitro są to hodowle roślin, części roślin, tkanek lub pojedynczych komórek na sztucznych pożywkach w jałowych warunkach (Pierik 1987).

Kultury in vitro

Znaczenie kultur in vitro

• Sposób uzyskiwania materiału do badań techniką kultur in vitro posiada szereg istotnych zalet takich jak:

• zapewnia większą jednorodność badanego materiału oraz uzyskanie dużych ilości roślin w krótkim czasie,

• warunki sterylne umożliwiają śledzenie metabolizmu podawanych egzogennie substancji w roślinach, pozwalają eliminować wpływ mikroorganizmów na wartości mierzonych parametrów fizjologicznych w roślinach,

• w naczyniach hodowlanych wegetacja kultur odbywa się w lepiej regulowanych i stabilizowanych warunkach w porównaniu z warunkami zewnętrznymi,

Znaczenie kultur in vitro

• Sposób uzyskiwania materiału do badań techniką kultur in vitro posiada szereg istotnych zalet takich jak:

• pozwala na uniezależnienie się od pory roku oraz określanie i regulowanie warunków hodowli,

• pozwala selekcjonować linie o podwyższonej odporności na herbicydy, pestycydy i inne środki ochrony roślin, co jest znacznie tańsze niż selekcja w warunkach polowych,

• umożliwia badanie procesów fizjologicznych takich jak reakcję na stresy, komunikację międzykomórkową, sekrecję różnych związków do środowiska (Sekrecka i Trendak, 1997; Dubert, 2000; Dubert i Płażek, 2007).

• Ponadto kultury in vitro zyskują coraz większe znaczenie w pracach hodowlanych, których celem jest otrzymywanie nowych, korzystnych dla człowieka genotypów roślin (Orlikowska, 1997).

Rodzaje kultur tkankowych.

• Wyróżniamy następujące rodzaje kultur in vitro:

• kultury kalusa,

• kultury zawiesinowe,

• kultury pojedynczych komórek,

• kultury protoplastów,

• kultury pylników i mikrospor,

• kultury zarodków,

• kultury fragmentów roślin,

Definicja kultur tkankowch.

• Kultury in vitro są to hodowle roślin, części roślin, tkanek lub pojedynczych komórek na sztucznych pożywkach w jałowych warunkach.

• Kultury in vitro są podstawą nowoczesnej biotechnologii której efekty końcowe w postaci nowych osobników bądź ich produktów są poddawane analizie biochemicznej (analityka) i ocenie ich przydatności do dalszych eksperymentów bądź wdrażania do masowego wykorzystania w różnych gałęziach gospodarki człowieka.

Kultury in vitro a biotechnologia

• Biotechnologia - dyscyplina nauk technicznych wykorzystująca procesy biologiczne na skalę przemysłową.
  

• Konwencja o różnorodności biologicznej ONZ podaje jedną z najszerszych definicji:

• Biotechnologia oznacza zastosowanie technologiczne, które używa systemów biologicznych, organizmów żywych lub ich składników, żeby wytwarzać lub modyfikować produkty lub procesy w określonym zastosowaniu.

Kultury in vitro w biotechnologii

• Produkcja żywności:

• - tradycyjne procesy fermentacyjne (produkcja pieczywa, produktów mlecznych),

• - nowe technologie mikrobiologii (witaminy, aminokwasy),

• - zastosowanie enzymów do wyrobów mleczarskich (kefiry, jogurty),

• - utrwalenie żywności (antyutleniacze)
  

• Rolnictwo:

• - produkcja pasz (preparaty białkowe, witaminowe, kiszonki roślinne),

• - kultury komórkowe i tkankowe in vitro,

• - ochrona roślin (bioinsektycydy, antybiotyki),

• - lecznictwo zwierząt (szczepionki)
  

• Ochrona środowiska:

• - oczyszczanie ścieków, filtry biologiczne, czynne osady

Biotranformacja

• Biotransformacje - katalizowane przez enzymy reakcje chemiczne, w których następuje przekształcenie określonego(nych) fragmentu(ów) substratu.

• Biotransformacje u mikroorganizmów można porównać do "biokatalizatorów", które przeprowadzają przemiany prowadzące do otrzymania pożądanego produktu.

• Są to procesy wykorzystujące najczęściej tylko jeden enzym i nie dostarczają komórce energii ani potrzebnych związków.

• Biotransformacje zachodzą też w formach przetrwalnikowych mikroorganizmów dzięki braku zaangażowania jakichkolwiek szklaków metabolicznych w proces.

• Jednym z ważniejszych problemów przy stosowaniu biotransformacji jest występujące ograniczenie przepuszczalności substratów i produktów przez błony cytoplazmatyczne lub też wydzielenie odpowiedniego enzymu z komórki.

• Dlatego też opracowanie specyficzne sposoby postępowania zależą od charakteru mikroorganizmu (np. środki powierzchniowo czynne).

Biotransformacja

• Co to są i na czym polegają biotransformacje roślin ?

• Biotransformacja - proces w wyniku którego dochodzi do modyfikacji grup funkcyjnych związków organicznych przez żywe komórki lub izolowanie z nich enzymy

• Zastosowanie:

• - do produkcji metabolitów wtórnych,

• - do biotransformacji egzogennych prekursorów w bardzo wartościowe,
  bądź pożądane produkty.
  

Biotransformacja

• Typy reakcji biotransformacji:

• - utlenianie, redukcja,

• - hydroliza,

• - rozszczepienie wiązania C-C,

• - kondensacja,

• - izomeryzacja

• Substraty:

• naturalne prekursory,

• związki syntetyczne (ksenobiotyki),

• związki obce roślinie

Biotransformacja

• Materiał stosowany:

• - izolowane enzymy,

• - zawiesiny komórkowe,

• - agregaty komórek,

• - immobilizowane (unieruchamiane) enzymy i komórki

Biotransformacja

• Lokalizacja procesu biotransformacji:

• - wytrząsanie kolby,

• - bioreaktory

Biotransformacja

• Dane ilościowe:

• - na świecie jest około 137 gatunków roślin leczniczych i aromatycznych wykorzystywanych do produkcji metabolitów wtórnych lub do biotransformacji prekursorów,

• - w Polsce tylko około 40 gatunków roślin (zostało przebadanych)
  

Biotransformacja

• Korzyści biotransformacji:

• - wysoka wydajność (często bliska 100%),

• - duża czystość produktu reakcji,

• - wysoka specyficzność reakcji,

• - możliwość zajścia reakcji w miejscach mało reaktywnych,

• - otrzymanie dużej ilości produktów występujących w małych ilościach w roślinie,

• - otrzymanie produktów o zwiększonej aktywności fermakologicznej lub zmniejszonej toksyczności
  

Biotransformacja

• Biotransformacja z użyciem kultur zawiesinowych - jest to najprostszy model doświadczalny, nie ma dodatkowego etapu wiązania komórek z nośnikiem, komórki nie ulegają zmianom fizjologicznym

Biotransformacja

• Czynniki regulujące reakcje biotransformacji:

• - rodzaj kultury (zawiesina, kultury organów np. korzeni),

• - stadium rozwojowe kultury i jej warunki, a zwłaszcza nadtlenianie, skład pożywki i jej pH,

• - struktura chemiczna substratu, jego stężenie, właściwości

Kultury in vitro

• Etapy

• 1.przygotowanie pożywki

• 2. sterylizacja materiału

• 3. wprowadzanie roślin na pożywkę

• Wyszczepianie

• Pasażowanie

• 4. przeniesienie do warunków hodowlanych i hodowla

Pożywka

• Pożywka to wodny roztwór podstawowych makro i mikroelementów.

• Powinna ona zawierać:

• 1. wodę

• 2. makroelementy

• 3. mikroelementy

• 4. ultraelementy

• 5. węglowodany

• 6. witaminy

• 7. regulatory wzrostu

• 8. inne składniki

Cechy pożywki

• Cechy dobrej pożywki to:

• 1. zawartość podstawowych składnikow (makro i mikroelementow)

• 2. odpowiednie proporcje składników

• 3. odpowiedni odczyn

Rodzaje i oznaczenia literowe najczęściej spotykanych pożywek

• Pożywka Murashige & Skoog (MS)

• Pożywka Linsmaier i Skoog (LS)

• Pożywka Gamborga (B5)

• Pożywka Nitscha

• Pożywka Tuleckiego

• Pożywka Hellera

• Pożywka Hildebrandta

• Pożywka White'a

Typy pożywek

• Typy pożywek (podział ze względu na jakościowy i ilościowy skład chemiczny):

• 1. Pożywki bogate (np. MS, LS, B5)

• 2. Pożywki średnio bogate (np. . pożywki Nitscha, Tuleckiego , Hellera)

• 3. Pożywki ubogie (np. pożywki Hildebrandta, White'a)

Typy pożywek

• Typy pożywek ze względu na stan zestalenia:

• 1. stałe

• 2. półpłynne

• 3. płynne

Wybór pożywki

• Decyzja odnośnie wyboru konkretnej pożywki dla danej rośliny zależy od:

• 1. przynależności taksonomicznej badanego gatunku rośliny

• 2. wieku rośliny

• 3. wieku organu

• 4. rodzaju organu

• 5. czasu prowadzenia kultury

• 6. procesu, który planuje się indukować w danej kulturze

Przygotowanie pożywki

• Przygotowanie pożywki.

• A) Ustalenie składu chemicznego.

• B) Ustalenie kwasowości pożywki

• C. Ustalenie stopnia zestalenia pożywki

• D) Ustalenie wymiany gazowej

• E) Autoklawowanie pożywki

Przygotowanie pożywki.

• A) Ustalenie składu chemicznego.

• Decyduje on o powodzeniu kultury i ustala się go w zależności od rodzaju kultury in vitro.

• Przydatność jej dla utrzymania żywotności inoculum zależy od takich właściwości jak:

• - dostępność składników pokarmowych

• - potencjał oksydoredukcyjny

• - odczyn

• - antagonizm i synergizm jonów

Przygotowanie pożywki.

• A) Skład chemiczny.

• 1) makroelementy - azot, siarka, fosfor, potas, magnez, wapń, żelazo, chlor.

• 2) mikroelementy - bor, miedź, mangan, molibden, cynk.

• 3) ultraelementy - kobalt, jod, glin, nikiel, tytan.

• 4) woda

• 5) inne związki (hormony, aminokwasy agar , cukier i inne)

Skład chemiczny.

• Azot - dodajemy do pożywek w formie nieorganicznej (azotanowej i amonowej) i organicznej (aminokwasy, peptony, białka).

• Na ogół formy azotanowe są pobierane szybciej, szczególnie w mniej korzystnych warunkach tlenowych.

• Niektóre rośliny np. ziemniaka, zbożowe, wolą formy amonowe chociaż w stanie dojrzałości lepiej reagują na formy azotanowe.

• Ze związków organicznych azotu należy wymienić szczególnie takie aminokwasy jak glicyna czy alanina a także kwas glutaminowy, asparaginowy, hydrolizat kazeinowy, peptony.

• Występuje w budowie białek, enzymów, aminokwasów, kwasów nukleinowych i innych związków.

Brak azotu u rośliny cytrusowej

Skład chemiczny.

• Siarka - najlepiej ją dostarczać w formie siarczanów.

• Zapotrzebowanie na siarkę częściowo zaspokajają dodawane do pożywki aminokwasy, witaminy oraz preparaty białkowe.

• Siarka dodawana do pożywki w formie siarkowodoru czy siarczków jest toksyczna.

• Występuje w budowie aminokwasów, peptydów, białek oraz witamin.

Brak siarki u rośliny cytrusowej

Skład chemiczny

• Fosfor - jest absorbowany przez roślinę w formie jednowartościowego lub dwuwartościowego jonu fosforanowego i w takiej postaci powinien występować w pożywce.

• Wchodzi w skład budowy cukrowców, nukleotydów, kwasów nukleinowych, fosfolipidów i koenzymów.

Brak fosforu u rośliny cytrusowej

Skład chemiczny

• Potas - bywa najczęściej podawany w formie azotanów, chlorków i fosforanów.

• Często dostarczenie do pożywki azotanu potasu zamiast azotanu amonu zmniejsza brunatnienie eksplantatów.

• Jest aktywatorem wielu enzymów i takich procesów jak fotosynteza, przemieszczanie asymilatów, przemiany związków organicznych.

Brak potasu u rośliny cytrusowej

Przygotowanie pożywki

• Przygotowanie pożywki.

• A) Ustalenie składu chemicznego.

• B) Ustalenie kwasowości pożywki

• C. Ustalenie stopnia zestalenia pożywki

• D) Ustalenie wymiany gazowej

• E) Autoklawowanie pożywki

Skład chemiczny

• Sód - dostarczany podobnie jak potas w formie azotanów, chlorków i fosforanów.

• Rola w roślinie nie jest bliżej poznana.

Skład chemiczny

• Magnez - podawany zwykle w postaci siarczanu magnezu.

• Może być zastąpiony przez mangan, cynk i kobalt ale tylko częściowo.

• Aktywuje różne enzymy, pełni ważną rolę w procesie fotosyntezy i oddychania.

Brak magnezu u rośliny cytrusowej

Skład chemiczny

• Wapń - podawany zwykle w formie chlorków lub azotanów.

• Niska zawartość wapnia w pożywce sprzyja toksycznemu działaniu nawet niewielkich ilości manganu, miedzi i żelaza.

• Jest niezbędny do budowy ścian komórkowych, utrzymania struktury błon, aktywności enzymów a także do polarnego transportu auksyn.

Skład chemiczny

• Żelazo - najczęściej stosowany jest w pożywkach związek kompleksowy żelaza z kwasem etylenodwuaminoczterooctowym lub sól sodowo-żelazowa tego kwasu (Fe-EDTA lub NaFeEDTA).

• Jest niezbędny w licznych procesach oksydoredukcyjnych w mitochondriach i chloroplastach.

Brak żelaza u rośliny cytrusowej

Skład chemiczny

• Chlor - wchodzi do pożywek w formie chlorków i pobierany jest w postaci jonu Cl^-.

• Rola w roślinie nie jest bliżej poznana.

• Ostatni z pierwiastków zaliczany do makroelementów

Skład chemiczny

• Bor - dodawany do pożywki jako kwas borowy i pobierany jako jon boranowy.

• Wpływa prawdopodobnie na budowę ścian komórkowych, metabolizm kwasów nukleinowych, uczestniczy w przemianach i transporcie węglowodanów.

Brak boru u rośliny cytrusowej

Skład chemiczny

• Miedź - dodawana do pożywki jako siarczan miedzi.

• Występuje w wielu enzymach, uczestniczy w przemianach tłuszczowców, występuje w fotosyntetycznym łańcuchu transportu elektronów.

Brak miedzi u rośliny cytrusowej

Skład chemiczny

• Mangan - dodawany do pożywki w formie siarczanu manganowego.

• Jest aktywatorem wielu reakcji (np. fotoliza wody) uczestniczy w utrzymaniu równowagi układu oksydoredukcyjnego.

Brak manganu u rośliny cytrusowej

Skład chemiczny

• Molibden - do pożywki dodaje się zwykle sole molibdenianowe zawierające jon MoO^4-.

• Bierze udział w przemianach azotu,, jest niezbędny przy syntezie i działaniu kwasu askorbinowego i wpływa na metabolizm związków fosforowych.

Brak molibdenu u rośliny cytrusowej

Skład chemiczny

• Cynk - dodawany do pożywki jako siarczan cynku.

• Bierze udział w syntezie substancji wzrostowych oraz wchodzi w skład wielu enzymów.

• Pełni ważne funkcje w metaboliźmie białkowym i fosforanowym oraz w procesie oddychania.

• Ostatni z pierwiastków zaliczany do mikroelementów

Brak cynku u rośliny cytrusowej

Skład chemiczny

• Kobalt - dodawany w formie chlorku kobaltu.

• Bierze udział w metaboliźmie roślin i wiązaniu azotu cząsteczkowego.

Skład chemiczny

• Jod - dodawany w formie jodku potasu.

• Rola bliżej nie jest znana ale w małych ilościach wpływa korzystnie na wzrost roślin.

Skład chemiczny

• Glin - dodawany w formie chlorku glinu.

• Stwierdzono jego wpływ na pęcznienie cytoplazmy i aktywność pewnych enzymów.

• Wpływa ogólnie korzystnie na wzrost roślin.

Skład chemiczny

• Nikiel - dodawany jako chlorek niklu.

• Prawdopodobnie wpływa na procesy związane z oddychaniem roślin.

Skład chemiczny

• Tytan - dodawany jako siarczan tytanu.

• Prawdopodobna rola nie jest znana ale korzystnie wpływa na wzrost roślin

• Ostatni z z pierwiastków zaliczany do ultraelementów

Witaminy

• Tiamina (B1, aneuryna) - dodawana do pożywki w formie chlorowodorku aneuryny w ilości 0,1-1 mg/dcm³.

• Jest ona prekursorem związków biorących aktywny udział w procesie fotosyntezy i oddychania.

Witaminy

• Kwas pantotenowy (należy do grupy witamin B: B3 lub B5) - dodawany do pożywki jako pantotenian wapnia w ilości 0,1-1 mg/dcm³.

• Bierze udział w przemianach kwasów tłuszczowych.

Witaminy

• Pirydoksyna (B6, adermina) - dodawana do pożywki w postaci chlorowodorku w ilości 0,1-1 mg/dcm³.

• Jej obecność jest istotna ponieważ fosforan pirydoksyny jest aktywatorem aminotransferaz.

Witaminy

• Biotyna (H) - dodawana do pożywki w ilości 0,1-1 mg/dcm³.

• Uczestniczy w procesie syntezy kwasów tłuszczowych.

Witaminy

• Kwas nikotynowy (PP, niacyna) - dodawana w formie kwasu nikotynowego w ilości 0,5-1 mg/dcm³.

• Bierze on udział w strukturze koenzymów dehydrogenaz i tworzeniu witaminy B2.

Witaminy

• Kwas askorbinowy (witamina C) - dodawana do pożywki w ilości 1-100 mg/dcm³.

• Bierze udział w reakcjach oksydoredukcyjnych, opóźnia także starzenie i brunatnienie tkanek.

Witaminy

• Kwas p-aminobenzoesowy - dodawany do pożywki w ilości 0,05-1 mg/dcm³.

• Dokładne znaczenie nie jest poznane, ale polepsza wzrost roślin.

Witaminy

• Kwas foliowy - dodawany do pożywki w ilości 0,01-0,1 mg/dcm³.

• Dokładne znaczenie nie jest znane ale polepsza wzrost roślin.

Regulatory wzrostu i rozwoju

• Auksyny - dodawane do pożywki w ilościach: IAA - 0,01-10 mg/dcm³, NAA, 2,4 D - 0,001-10 mg/dcm³.

• Odgrywają znaczną rolę w procesach wzrostu i rozwoju roślin.

• Zostały więc wykorzystane do pobudzania regeneracji brakujących organów, inicjowania wegetatywnych pąków, namnażania komórek kalusa.

• Kalus na pożywce bez auksyn nie może rosnąć i nie zachodzą w nim żadne procesy organogenezy.

Auksyny w kulturach in vitro

• W kulturach in vitro auksyny inicjuja podziały komórkowe co w konsekwencji prowadzi do wytworzenia kalusa.

• Powodują także elongację komórek , stymulują tworzenie korzeni i indukują somatyczną embriogenezę.

• Kultury przetrzymywane przez dłuższy czas w obecności auksyny dodanej do pożywki zaczynają same syntetyzować endogenną auksynę uniezależniając się w ten sposób od auksyny egzogennej.

• Syntetyczne auksyny stosowane w kulturach in vitro są bardziej aktywne niż te naturalne

• Spośród syntetycznych auksyn do pożywek dodajemy najczęściej: kwas α-naftylo-1-octowy (NAA), kwas indolilo-3-masłowy (IBA), kwas 2,3-dichlorofenoksyoctowy (2,4-D).

• Po autoklawowaniu pożywki i podczas przechowywania na świetle poziom auksyn w pożywce obniża się.

Regulatory wzrostu i rozwoju

• Gibereliny - dodawane niekiedy do pożywek w formie kwasu giberelowego (GA3).

• Regulator ten na ogół nie jest niezbędny dla większości eksplantatów, lecz często polepsza ich wzrost i rozwój w kulturach in vitro.

Gibereliny w kulturach in vitro

• W kulturach in vitro wykorzystywanie giberelin jest o wiele rzadsze niż auksyn i cytokinin.

• Stosuje się je najczęściej w celu wydłużanie pędów lub przerywania stanu spoczynku izolowanych zarodków.

Regulatory wzrostu i rozwoju

• Cytokininy (zeatyna, kinetyna, 6-benzyloaminopuryna, adenina) - dodawane do pożywek w ilości 0,1-40 mg/dcm³.

• Powodują dzielenie się komórek, mobilizują również składniki pokarmowe i wywołują reakcje odmładzania.

• W pożywce istotny jest stosunek cytokinin do auksyn, gdyż od niego zależy wzmożony rozwój części pędowych lub korzeniowych i kalusa.

Cytokininy w kulturach in vitro

• Cytokininy w kulturach in vitro wykorzystywane są w celu indukowania podziałów komórkowych, inicjacji merystemów pędowych, znoszenia dominacji wierzchołkowej, a stymulacji wyrastania pędów bocznych, zahamowania tworzenia korzeni, oraz opóźniania procesu starzenia.

• Egzogenne cytokininy najczęściej stosowane w kulturach in vitro 6-dimetyloalliliaminopuryna (2iP), kinetyna (K) i benzyloadenina (BA).

• Decydujące znaczenie w rozwoju pędu lub korzeni ma stosunek auksyn do cytokinin w pożywce.

• Wysokie stężenie auksyn w stosunku do cytokinin stymuluje wytwarzanie korzeni a wysokie stężenie cytokinin w stosunku do auksyn stymuluje namnażanie pędów bocznych.

Regulatory wzrostu i rozwoju

• Inhibitory wzrostu (ABA, związki fenolowe) - powstrzymują wzrost pąków i kiełkowanie nasion, przyśpieszają starzenie, opadanie liści i hamują kwitnienie.

ABA w kulturach in vitro

• Kwas abscysynowy w kulturach in vitro wykorzystywany jest przy regulacji przebiegu somatycznej embriogenezy.

• Umożliwia on u niektórych gatunków wykształcanie somatycznych zarodków.

• Znalazł on także zastosowanie w hamowaniu przedwczesnego kiełkowania zarodków oraz indukcji odporności na odwodnienie.

Regulatory wzrostu i rozwoju

• Etylen - hamuje wzrost, znosi działanie auksyn, przyśpiesza dojrzewanie owoców, wzmaga defoliację.

Etylen w kulturach in vitro

• W kulturach in vitro obserwowano zarówno pozytywny wpływ etylenu na eksplantaty jak i negatywny.

• Obserwowany pozytywny wpływ polegał na stymulacji wzrostu tkanki kalusowej , stymulacji wzrostu wydłużeniowego, zwiększenia produkcji zarodków somatycznych

• Negatywny wpływ to zahamowanie wzrostu, zmniejszenie liczby wytwarzanych zarodków czy ich nieprawidłowy rozwój.

Etylen w kulturach in vitro

• W kulturach in vitro rośliny znacznie częściej są narażone na działanie zbyt wysokich stężeń etylenu niż w warunkach in vivo dlatego że hodowla odbywa się w zamkniętych pojemnikach, cięty materiał zwiększa wskutek stresu wydzielanie etylenu a obecność auksyn i cytokinin w pożywce jak również agaru wpływa na wydzielanie etylenu.

• Czasem także materiał z którego wykonany jest pojemnik może powodować wzrost stężenia etylenu.

• Może stanowić to przyczynę zakłóceń we wzroście i rozwoju, przyśpieszanie procesu starzenia, żółknięcia liści i opadania organów.

Etylen w kulturach in vitro

• Podwyższone stężenie etylenu w pojemniku do hodowli uzyskuje bądź przez jego bezpośrednią aplikację do wnętrza bądź tez przez dodanie do pożywki etefonu, który w tkankach roślinnych rozkłada się z wydzielenie etylenu lub jego prekursora.

• Natomiast obniżenie stężenia etylenu uzyskuje się poprzez blokadę jego biosyntezy przez inhibitory biosyntezy takie jak: aminoetoksywinyloglicynę (AVG), kwas aminooksyoctowy (AOA), dinitrofenol lub jony kobaltu.

Etylen w kulturach in vitro

• Etylen można też usuwać przez wentylację pojemnika lub jego pochłanianie przez roztwór nadmanganianu potasu lub nadchloranu rtęci.

• Można też zablokować działanie etylenu na poziomie komórkowym przez specyficzne inhibitory wiązania etylenu takie jak jony srebra lub norbornadien

Związki jasmonowe

• Związki jasmonowe (kwas jasmonowy -JA) - kwas jasmonowy i jego pochodne stymulują ustępowanie głębokiego spoczynku nasion, zamykanie aparatów szparkowych, rozwój bulw, dojrzewanie owoców, starzenie się liści i opadanie organów.

• Hamują kiełkowanie nasion, pyłku, zarodników, wzrost elongacyjny, tworzenie się pąków a także uczestniczą w reakcji rośliny na stres.

Kwas jasmonowy

• W kulturach in vitro wykazano poprzez działanie metylowej pochodnej JA wpływ na hamowanie wzrostu kalusa soi, ryżu, lucerny.

• Ale wykazano także że sam JA stymulował wzrost kalusa, korzeni i pędów ziemniaka.

• JA-Me blokował także indukcję somatycznej embriogenezy i rozwój somatycznych zarodków lucerny

Przygotowanie pożywki i wprowadzanie na nią fragmentów roślin

• Etapy

• 1.przygotowanie pożywki

• 2. sterylizacja materiału

• 3. wprowadzanie roślin na pożywkę

• Wyszczepianie

• Pasażowanie

• 4. przeniesienie do warunków hodowlanych i hodowla

Poliaminy

• Poliaminy, zwane też poliaminami alifatycznymi (PA) to związki organiczne o małej masie molowej, mające w swojej strukturze grupy aminowe (—-NH2).

• Część z nich występuje w komórkach ludzi, zwierząt i bakterii i określana jest mianem amin biogennych np. kadaweryna, putrescyna, spermidyna.

• Poliaminy biorą udział w wielu biochemicznych procesach komórkowych.

• Niektóre są hormonami roślinnymi i koenzymami.

Poliaminy

• Poliaminy (putrescyna, spermidyna i spermina) mają największe znaczenie w regulacji podziałów komórkowych i dalszego różnicowania.

• W kulturach in vitro poliaminy stymulowały podziały komórkowe, uczestniczyły w inicjacji korzeni oraz indukcji somatycznej embriogenezy.

Aminokwasy

• Do pożywek dodawane następujące aminokwasy i amidy: cysteina, glicyna, alanina, arginina, asparagina, kwas asparaginowy, cystyna, kwas glutaminowy, glutamina, histydyna, izoleucyna, leucyna, lizyna, metionina, fenyloalanina, pralina, seryna, treonina, tryptofan, tyrozyna i walina.

• Są one dodawane do pożywek w formie L.

Formy D i L związków

• Związki, które mają choćby 1 asymetryczny atom węgla nazywamy związkami aktywnymi optycznie, tzn. mają one zdolność skręcania płaszczyzny polaryzacji światła.

• Jeśli skręcają tę płaszczyznę w prawo - są to formy D, jeśli w lewo - formy L.

• Najważniejsze związki tego typu występujące w organizmie ludzkim to cukry i aminokwasy.

• Większość cukrów występująca naturalnie w przyrodzie to formy D.

• Aminokwasy z kolei mają formę L.

• Enzymy katalizujące reakcje chemiczne w organizmie żywym działają jedynie na formy naturalnie występujące w organizmie, nie działają na ich odbicia lustrzane.

Inne substancje w pożywce

• Węglowodany - najczęściej do pożywek dodawane są: sacharoza w ilości 1-5%, glukoza w ilości 3-4%, fruktoza w ilości 3-4% bądź też obydwa ostatnie cukry łącznie.

• Inozytol - (mioinozytol lub mezoinozytol) - pochodna alkoholowa cukrów prostych, wchodząca w skład fosfolipidów

Inozytol

• Inozytol (najczęściej spotykaną w przyrodzie formą występowania jest myo-inozytol) to nazwa zwyczajowa cykloheksanheksolu - cyklicznego sześciowęglowego alkoholu polihydroksylowego posiadającego sześć grup hydroksylowych (cukrol).

• Zależnie od położenia grup hydroksylowych istnieje teoretycznie dziewięć stereoizomerów inozytolu, przy czym istnieje para enanciomerów (chiro-Inozytol).

• W najczęściej występującej formie grupy hydroksylowe przy węglach 1, 2, 3 i 5 znajdują się po tej samej stronie pierścienia, a grupy hydroksylowe przy węglach C4 i C6 po przeciwnej stronie.

• Ta forma nosi nazwę systematyczną cykloheksan-cis-1,2,3,5-trans-4,6-heksol, nazwę zwyczajową myo-Inozytol i występuje w wielu roślinach i zwierzętach.

Agar

• Agar-agar, agar, E406 - substancja żelująca, której głównym składnikiem jest trudno przyswajalny przez człowieka cukier galaktoza.

• Agar-agar dobrze rozpuszcza się w wodzie o temperaturze ok. 90-100°C, a zestala się tworząc rodzaj żelu w 40-50°C. Zestalony żel rozpuszcza się po ponownym podgrzaniu do 90-100°C.

• Agar-agar wytwarzany jest z krasnorostów (Rhodophyta), wydobywanych głównie u wybrzeży Japonii (często pozyskiwanych z podwodnych plantacji). Obecnie obserwuje się wzrost produkcji agar-agaru ze względu na rosnące zapotrzebowanie.

Agar

• Agar, agar-agar, polisacharyd zbudowany głównie z agarozy i agaropektyny, galaretowata, koloidalna substancja otrzymywana z glonów (krasnorostów występujących w Oceanie Indyjskim i w zachodniej części Oceanu Spokojnego).

• Rozpuszcza się w gorącej wodzie, w zimnej pęcznieje przechodząc w żel.

• Agar, w postaci proszku, włókien i krążków, używany jest m.in. w przemyśle spożywczym (zamiast żelatyny), kosmetycznym, farmaceutycznym oraz w bakteriologii jako składnik pożywek bakyeryjnych, w lecznictwie jako środek przeczyszczający, w przemyśle papierniczym i tekstylnym do apreturowania papieru i jedwabiu.

Agaroza

• Agaroza to polisacharyd będący polimerem pochodnych galaktozy, otrzymywany przez oczyszczanie z agaru jadalnego.

• Agaroza jest łatwo rozpuszczalna w wodzie, w temperaturze pokojowej odwracalnie tworzy żel.

• Temperatura przejścia żelu z zol (potocznie topnienie agarozy) jest wyższa od temperatury zestalania (histeraza).

Agaroza

• Zastosowania agarozy

• Agaroza ma zastosowanie w technikach analitycznych i preparatywnych biologii molekularnej.

• Żel agarozowy służy jako podłoże do elektroforetycznego rozdzielania kwasów nukleinowych. Zmodyfikowana chemicznie agaroza służy jako podłoże w chromatografii powinowactwa oraz jako sito molekularne.

• Żel agarozowy wykorzystuje się też do unieruchamiania preparatów do sekcji na mikrotomie.

• Zdolność komórek do wzrostu na podłożu z miękkiego żelu agarozowego jest jednym z testów na transformację nowotworową.

Inne substancje

• Agar - (polisacharyd zbudowany głównie z galaktozy, składnik ścian komórkowych glonów).

• Stosujemy najczęściej Bacto-Agar w ilości 0,5-0,8% lub Difco-Noble Agar w ilości 0,6-1%.

• Możemy także stosować substytuty agaru, przypominające właściwościami agar polecane przez różne firmy.

Substytuty agaru np.kurdlan

• Zastosowanie kurdlanu

• Główne zastosowania kurdlanu wynikają wprost z jego unikalnych cech.

• Już krótko po odkryciu planowym zastosowaniem kurdlanu stało się użycie go głównie w przemyśle spożywczym jako substytutu naturalnych polisacharydów roślinnych oraz preparatu zagęszczającego (żelifikującego).

• Ze względu na obecność wiązań β-(1→3)-glikozydowych które nie są hydrolizowane przez enzymy trawienne człowieka kurdlan charakteryzuje się niską wartością kaloryczną co sugeruje możliwe jego wykorzystanie w produktach dietetycznych.

Substytuty agaru - kurdlan

• Zastosowanie kurdlanu

• Z kolei tworzenie przez kurdlan żeli odpornych na zamrzanie oraz zdolnych do wchłaniania dużej ilości cukrów sugeruje możliwość wykorzystania tego polimeru w produkcji lodów, mrożonek i wyrobów cukierniczych.

• Może on być wykorzystywany także w produkcji zup oraz deserów, ponieważ jest dodatkiem nadającym płynom pseudoplastyczny charakter, zagęszczającym oraz stabilizującym żywność.

• Kurdlan został dopuszczony do stosowania w przemyśle spożywczym w Japonii, gdzie stanowi składnik różnych pokarmów (głównie cukierniczych), ale na razie nie jest akceptowany jako składnik żywności w USA i Unii Europejskiej.

• Kurdlan wykorzystywany jest również przy tworzeniu biodegradowalnych i nierozpuszczalnych w wodzie błon.

Węgiel aktywowany

• Węgiel aktywny (aktywowany) - substancja składająca się głównie z węgla pierwiastkowego w formie bezpostaciowej (sadza), częściowo w postaci drobnokrystalicznego grafitu (poza węglem zawiera zwykle popiół, głównie tlenki metali alkalicznych i krzemionkę).

• Charakteryzuje się bardzo dużą powierzchnią w przeliczeniu na jednostkę masy (500÷2500 m˛/g - dla porównania powierzchnia kortu tenisowego wynosi około 260 m˛), dzięki czemu jest doskonałym adsprbentem wielu związków chemicznych.

Węgiel aktywowany

• Wielka powierzchnia właściwa węgla aktywnego jest wynikiem istnienia wewnętrznej struktury porowatej odziedziczonej w dużym stopniu po wyjściowym materiale organicznym, a rozwiniętej w procesie wygrzewania w wysokiej temperaturze przy ograniczonym dostępie powietrza.

• Większość porów to silnie adsorbujące mikropory oraz pełniące głównie rolę kanałów transportowych mezopory.

• Węgiel aktywny jest często modyfikowany (np. przez usunięcie popiołu lub impregnację związkami chemicznymi), aby zachowując swoje właściwości adsorpcyjne, mógł bardziej specyficznie pochłaniać określony składnik (np. metale ciężkie).

Inne substancje

• Węgiel aktywowany - dodawany do pożywek w ilości 2%.

• Pochłania prawdopodobnie inhibitory wzrostu, absorbuje endogenne i egzogenne regulatory wzrostu i rozwoju, wpływa niekiedy korzystnie na wzrost izolowanych wycinków roślin a także organogenezę w kulturach pylników i ukorzenianie się roślin.

Właściwości chemiczne i fizyczne pożywki

• Przygotowanie pożywki.

• B) Ustalenie kwasowości pożywki

• Kwasowość pożywki - najodpowiedniejsze pH waha się w granicach 5,5-6,0.

• Doprowadzamy pH do odpowiedniej wartości zasadą sodową lub potasową (NaOH i KOH) lub kwasem solnym (HCl) przed autoklawowaniem.

• W czasie trwania eksperymentu pożywka kwaśnieje, pH poniżej 4,5 doprowadza do zniszczenia eksplantatu.

Właściwości chemiczne i fizyczne pożywki

• C. Ustalenie stopnia zestalenia pożywki - stopień zestalenia ustala się dobranym stężeniem agaru.

• Niektóre eksplantaty rosną lepiej na płynnej pożywce (np. pąki) inne na zestalonej (np. merystemy),

Właściwości chemiczne i fizyczne pożywki

• D) Ustalenie wymiany gazowej

• Wymiana gazowa - dla właściwego przebiegu procesów życiowych potrzebny jest stały dopływ tlenu i dwutlenku węgla.

• Zmniejszenie stężenia tlenu sprzyja tworzeniu pędów, zwiększenie stymuluje ukorzenianie się.

• Kultury tkankowe mają znacznie ograniczone zdolności asymilacji CO₂, ale jest on niezbędny do innych procesów życiowych dzielącym się komórkom.

• Eksplantaty rosnące na pożywkach stałych mają zapewniony dostęp O₂ i CO₂ a na pożywkach płynnych umożliwia im to wstrząsanie.

Przygotowanie pożywki.

• Przygotowujemy najpierw tzw. roztwory macierzyste to jest wodne roztwory kilku związków, które możemy mieszać ze sobą bez obaw, że będą one reagować ze sobą i unieaktywniać niektóre jony.

• Zestaw związków jest podany w odpowiednich tabelach.

Najczęściej stosowane pożywki

• Mogą to być pożywki:

• Gamborga (1965)

• Gamborga i wsp. (1968),

• Hellera (1953),

• Knopa (1894).

• Knudsona (1946),

• Linsmaiera i Skooga (1965)

• Murashige, Skooga ( 1962),

• Nitcha, Nitcha i Lichtera (1981),

• White'a (1963)

Najczęstsze składniki pożywek

• Skład najczęściej stosowanych pożywek

• A)Makroelementy KNO₃, KH₂PO₄, NaH₂PO₄ x H₂O, NH₄NO₃, (NH₄)₂SO₄, MgSO₄ x 7H₂O, CaCl₂ x 2H₂O, Ca(NO₃)₂ x 4H₂O, KCl, Na₂SO₄

• B)Mikroelementy H₃BO₃ ,MnSO₄ x 4H₂O, NaFeEDTA, Na₂EDTA, FeSO₄ x 7H₂O, Fe₂(SO₄)₃, CoCl₂ x 6H₂O, CuSO₄ x 5H₂O, ZnSO₄ x 7H₂O, Na₂MoO₄ x 2H₂O, KI0

• C) Substancje organiczne Glicyna, Tiamina HCl, Pirydoksyna HCl, Cysteina HCl, Kwas nikotynowy, Kwas foliowy, Myo-inozytol, Pantotenian-Ca, Biotyna, Glutation, L-glutamina, L-seryna, Sacharoza, 2,4-D, IAA, Kinetyna

Przykładowe składy pożywek

Pożywki w proszku

• Możemy także coraz częściej posługiwać się sproszkowanymi pożywkami, produkowanymi przez różne firmy produkujące odczynniki, gdzie wystarczy tylko naważyć odpowiednią ilość pożywki i rozpuścić ją w wodzie.

Sporządzanie pożywki.

• Przygotowanie roztworów macierzystych

• Odmierzenie odpowiedniej ilości każdego z roztworów macierzystych lub naważenie pożywki stałej,

• Odważenie pozostałych składników (najczęściej cukier, agar)

• Połączenie razem i uzupełnienie wodą,

• Doprowadzenie do odpowiedniego pH,

Sporządzanie pożywki.

• Przygotowanie pożywki.

• D) Autoklawowanie pożywki

• Zagotowanie pożywki do całkowitego rozpuszczenia się agaru (0,5-1 godziny),

• Rozlewanie gorącej pożywki do wysterylizowanych naczyń szklanych (kolbki Erlenmayera, słoiki, probówki, plastikowe pojemniki)

• Sterylizacja pożywki w naczyniach w autoklawie, najczęściej w temperaturze 119^OC, przy ciśnieniu 0,8-1,0 atmosfery prze 15- 20 minut

• Zastygnięcie pożywki (około 1-2 godzin) w warunkach sterylnych,

• Wyszczepianie na przygotowaną pożywkę wysterylizowanych eksplantatów w komorze do szczepień z laminarnym nadmuchem sterylnego powietrza..

Autoklaw i autoklawowanie

• Autoklaw - hermetycznie zamknięty, ogrzewany zbiornik służący do przeprowadzania różnych procesów chemicznych lub do wyjaławiania w podwyższonej temperaturze i przy zwiększonym ciśnieniu, np. narzędzi chirurgicznych, środków spożywczych i farmaceutycznych.

• Autoklaw składa się zazwyczaj z następujących elementów:

• 1.naczynia głównego o grubych ściankach, zdolnych wytrzymywać wysokie ciśnienie

• 2.pokrywy o równie grubych ściankach, posiadająca kryzę zamykaną na śruby, co tworzy mocne i szczelne połączenie

• 3.manometru pokazującego panujące wewnątrz nadciśnienie

• 4.zaworu ciśnieniowego, pełniącego rolę zabezpieczenia przed eksplozją gdyby wewnątrz autoklawu powstało zbyt wysokie ciśnienie.

AUTOKLAW KLASA B

• AUTOKLAW KLASA B      

• Są one jednymi z najbardziej zaawansowanych sterylizatorów parowych.

• Potrafią sterylizować praktycznie każdy rodzaj materiałów, zwłaszcza w kierunku długich, cienkich przewodów, jak na przykład cewniki, igły, endoskopy, wzierniki, końcówki stomatologiczne itp.

• Prezentowane przez klasę B funkcje nie są dostępne w pozostałych klasach autoklaw, S oraz N.

• Najważniejszą cechą, która wyróżnia autoklawy klasy B to frakcjonowana próżnia wstępna.

• Całkowite usunięcie powietrza otrzymuje się poprzez sekwencję impulsów próżni i wstrzyknięć pary.

• Jak do tej pory jest to najlepsza z istniejących technik, która daje możliwość sterylizacji każdego rodzaju produktu.

AUTOKLAW KLASA N

• AUTOKLAW KLASA N      

• Jest to najniższa klasa tego typu urządzeń.

• Autoklawy klasy N służą przede wszystkim do sterylizacji materiałów prostych, jak na przykład lite, nieopakowane wsady.

• Dzięki takim urządzeniom nie można niestety sterylizować wsadów wgłębionych, porowatych czy też narzędzi opakowanych, gdyż funkcje, którymi dysponuje się w przypadku tego urządzenia fizycznie nie spełniają odpowiednich wymagań, przez co nie zostało potwierdzone bezpieczeństwo przy sterylizacji takich wsadów w tego typu autoklawach.

• Autoklawy takie posiadają najniższe cechy funkcjonalne, jednakże równocześnie odpowiadają wysokim wymaganiom technicznym.

AUTOKLAW KLASA S

• AUTOKLAW KLASA S      

•  Urządzenia te należą do gatunku prawdziwie zaawansowanych sterylizatorów parowych.

• Są one w stanie wysterylizować wsady do typu B, jednakże nie nadają się do sterylizacji wsadów typu A, do których należą między innymi narzędzia o budowie kapilarnej.

• Klasa S stanowi coś pośredniego pomiędzy klasami B oraz N.

• Możliwe jest w nich praktycznie całkowite usuwanie powietrza z komory przed procesem sterylizacji dzięki działaniu pompy próżniowej, która jest wbudowana w urządzenie.

• Usuwanie powietrza w autoklawach klasy S jest znacznie mniej skomplikowane, ale równocześnie mniej skuteczne niż w autoklawach typu B. Występuje tutaj tylko jednostopniowa próżnia wstępna.

Autoklawowanie

• Autoklawowanie to w naszym przypadku proces wyjaławiania pożywki w podwyższonej temperaturze i przy zwiększonym ciśnieniu.

Wyszczepianie lub wszczepianie

• Wyszczepianie jest to proces przeniesienia wysterylizowanego fragmentu roślinnego (lub nawet pojedynczej komórki czy grupy komórek) na wysterylizywaną (wyjałowiona) pożywkę.

Pasażowanie

• Pasażowanie jest to proces przeniesienia rośliny lub fragmentu roślinnego rosnącego w kulturze in vitro na świeżą wysterylizowaną pożywkę.

Kultura in vitro