Kultury in vitro
Materiał roślinny
Etapy przygotowania kultury in vitro
Etapy
1.przygotowanie pożywki
2. sterylizacja materiału
3. wprowadzanie roślin na pożywkę
wyszczepianie
pasażowanie
4. przeniesienie do warunków hodowlanych i hodowla
Etapy przygotowania kultury in vitro
Wybór i sterylizacja materiału
Wybór materiału
Dokonując wyboru materiału roślinnego powinniśmy wziąć pod uwagę:
- wiek rośliny matecznej – im młodszy to wyższa zdolność regeneracyjna
- wiek organu – organy młode wyróżniają się dobrym wzrostem w kulturach in vitro
- porę roku – w okresie wiosennym ujawnia się wyższa zdolność regeneracyjna
- warunki wzrostu rośliny matecznej - eksplantaty z roślin rosnących w warunkach zbliżonych do optymalnych są najkorzystniejsze
Źródła materiału
Wybór fragmentu rośliny zależy od przeznaczenia zakładanej kultury.
Inne fragmenty będziemy pobierać do masowego namnażania (merystem wierzchołkowy), inne do protoplastów (fragmenty liści).
Ważny jest także termin pobierania fragmentu rośliny. Wczesna wiosna (luty) sprzyja najbardziej dobremu wzrostowi eksplantatów a okres miedzy październikiem a styczniem uważany jest za najgorszy.
Ważny jest też wiek rośliny i organu. Lepszy jest jak najmłodszy.
O losach kultury decyduje w dużej mierze właściwy dobór materiału roślinnego. Dlatego też bardzo istotne jest prawidłowe dokonanie tego wyboru a następnie takie sterowanie rozwojem aby zyskać pożądany efekt.
Źródła materiału
Źródła materiału
Odkażanie materiału
Dokładne odkażenie wybranego fragmentu rośliny decyduje o otrzymaniu kultury in vitro.
Należy więc najpierw określić w przybliżeniu jakie mikroorganizmy mogą zasiedlać jej powierzchnię.
Należy wziąć pod uwagę, z jakiego środowiska brany jest egzemplarz roślinny do namnożenia (rosnące na wolnym powietrzu posiadają więcej drobnoustrojów niż rosnące w szklarni).
Egzemplarze przeznaczone do namnożeń in vitro powinny być podlewane od dołu co zmniejsza na nich ilość drobnoustrojów.
Organy podziemne są trudniejsze do odkażeń niż nadziemne (grzyby często przerastają tkanki bulw i cebul).
Zakażenia
Rodzaje zakażeń:
a) wirusowe
b) bakteryjne
c) grzybowe
Zakażenia wirusowe
Rodzaje zakażeń
a) wirusowe
Wirusy (łac. virus - trucizna) – są to zbudowane z białek i kwasów nukleinowych, skomplikowane cząsteczki organiczne nie posiadające struktury komórkowej, namnażają się (tak nazywa się kopiowanie wirusów) przez infekowanie żywych komórek.
Wirusy wykorzystują do namnażania aparat kopiujący zawarty w żywych komórkach.
Zawierają materiał genetyczny w postaci RNA (retrowirusy) lub DNA, wykazują jednak zarówno cechy komórkowych organizmów żywych, jak i materii nieożywionej.
Zakażenia wirusowe
W wyniku zarażenia wirusem u roślin mogą wystąpić następujące objawy:
zmiany koloru (plamy, smugi),
martwica tkanek (nekroza),
zaburzenia wzrostu (karłowatość) lub rozwoju.
Istotną rolę w przenoszeniu wirusów roślinnych odgrywają roślinożerne zwierzęta (np. owady lub nicienie).
Wirusy roślinne mogą namnażać się w zaatakowanej komórce, osiągając ogromną liczbę kopii. Na przykład wirus mozaiki tytoniowej może stanowić ponad 10 procent suchej masy zaatakowanej rośliny.
Zakażenia wirusowe
Choroby wywoływane przez wirusy (wiriozy).
Wirusy wnikają do roślin biernie tylko przez maleńkie zranienie, kiedy tkanka dookoła ranki jest żywa, ponieważ wirusy żyją tylko na tkankach żywych, ścisłych.
Wirusy nie mogą same się rozmnażać, dlatego też wykorzystują do tego celu metabolizm rośliny.
Zakażenia wirusowe
Przykładowe choroby wirusowe roślin
Mozaika tytoniowa
Mozaika zwykła fasoli
Mozaika żółta fasoli
Mozaika ogórka.
Mozaika jabłoni
Pstrość tulipana
Żółtaczka buraka
Brązowa plamistość pomidora
Liściozwój ziemniaka
Mozaika pomidora.
Żółta karłowatość cebuli
Wirus M na ziemniaku
Pierścieniowa plamistość tytoniu
Szarka śliwy
Smugowatość ziemniaka
Kędzierzawka ziemniaka
Kędzierzawka plaszczyńcowa buraka
Zakażenia wirusowe
Wirusy mogą zimować w:
nasionach,
bulwach,
cebulach,
roślinach wieloletnich,
ciałach owadów - wektorów.
Zakażenie wirusowe – mozaika wirusowa na ogórku
Zakażenia bakteryjne
Rodzaje zakażeń
b) bakteryjne
Bakterie (od gr. bakterion "pałeczka") – są to jednokomórkowe lub kolonijne organizmy o budowie prokariotycznej.
Dwa podstawowe typy to bakterie tlenowe (do życia potrzebują tlenu) i beztlenowe (do życia potrzebują środowiska beztlenowego).
Zakażenia bakteryjne
Choroby bakteryjne roślin – bakteriozy
Do wnętrza roślin bakterie wnikają przez otwory naturalne (np. szparki) lub przez uszkodzenia mechaniczne (np. pęknięcia, zranienia).
Żyją zwykle w przestworzach międzykomórkowych, niektóre wnikają do żywych komórek.
Zakażenia bakteryjne
Bakterie wydzielają toksyny, które mogą powodować:
Rozluźnienie tkanki, poszczególne komórki oddzielają się od siebie i zamierają. Tkanka przekształca się w papkowatą, gnijącą masę. Choroba ta to mokra zgnilizna. Występuje między innymi na bulwach ziemniaków, korzeniach marchwi, pietruszce.
Bakterie powodujące mokrą zgniliznę mogą atakować także pędy roślin, wywołując chorobę zwaną czarną nóżką.
Bakterie mogą wywoływać również takie objawy jak wycieki śluzu lub gumy na pędach drzew, zgorzel kwiatków, zasychanie wierzchołków pędów, nekrotyczne rany na gałęziach i konarach np.: zaraza ogniowa, rak bakteryjny
niektóre bakterie zatykają naczynia co powoduje więdnięcie roślin lub pobudzają tkanki żywiciela do nadmiernego rozrastania się co prowadzi do powstawania guzowatych narośli na pniach lub korzenia drzew.
Zakażenia bakteryjne
Przykładowe choroby bakteryjne:
Bakteryjna centkowatość pomidora (Pseudomonas syringe pv. tomato)
Kanciasta plamistość ogórka (Pseudomonas syringe pv. lachrymans)
Bakterioza obwódkowa fasoli (Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola)
Bakteryjna zaraza pelargonii (Xanthomonas hortorum pv. pelargonii)
Mokra zgnilizna bakteryjna (Erwinia carotovora subsp. carotovora)
Zakażenie bakteryjne – mokra zgnilizna bakteryjna sałaty
Zakażenia grzybowe
Rodzaje zakażeń
c) grzybowe
Grzyby (Mycota, Mycetes, Fungi (w l. poj. Fungus)) – jest to królestwo należące do organizmów eukariotycznych, w zależności od ujęcia systematycznego w randze królestwa lub podkrólestwa.
Istnienie grzybów zaobserwowano we wszystkich strefach klimatycznych, przede wszystkim na lądach, rzadziej w wodach.
Zakażenia grzybowe
Przykładowe choroby grzybowe roślin.
Szara pleśń
Mączniak prawdziwy
Rdza
Parch jabłoni i gruszy
Mączniak rzekomy
Zaraza ogniowa
Fytoftoroza
Kędzierzawość liści brzoskwini
Objawy chorób grzybowych
Mączniak prawdziwy
Objawy: mączysty nalot, biały do brunatnego na górnej i dolnej stronie liścia.
Może porażać też pędy i kwiaty.
W efekcie uszkodzone tkanki schną, liście opadają wreszcie cała roślina może zamrzeć.
Objawy chorób grzybowych
Mączniak rzekomy
Objawy: mączysty, białawy do brunatnego nalot na dolnej stronie liścia.
W odróżnieniu od opisanego wyżej mączniaka prawdziwego porażona jest głównie dolna strona liścia.
Natomiast na górnej widoczne są jaśniejsze plamy.
W wyniku porażenia następuje więdnięcie i opadanie zainfekowanych liści.
Objawy chorób grzybowych
Szara pleśń
Objawy: białawy do brunatnego, szarego nalotu na liściach, pędach, kwiatach lub owocach.
Objawy chorób grzybowych
Rdza
Objawy: na spodniej stronie liścia widoczne rude, brązowe lub pomarańczowe pęcherze, natomiast na wierzchniej widać jasne plamki.
W konsekwencji liście więdną i zasychają.
Objawy chorób grzybowych
Askochytoza
Objawy: zwiędnięte liście, zwisające pędy, plamy czerwonobrunatne w pachwinach liści.
Na liściach występują okrągłe lub lekko wydłużone żółtobrunatne plamy z ciemniejszą obwódką.
Objawy chorób grzybowych
inne: plamistości liści
Objawy: żółte lub brunatne plamy rozsiane na blaszce liściowej. Liście przedwcześnie opadają.
Sadzaki
Objawy: prawie czarny nalot na liściach.
Zakażenia grzybowe – szara pleśń na truskawce
Usuwanie zakażeń – sposoby sterylizacji
W przypadku zwalczania chorób wirusowych możemy stosować:
chemoterapię
termoterapię
krioterapia
izolacje merystemów wierzchołkowych
Chemioterapia
Chemioterapia polega na stosowaniu antymetabolitów czyli związków które charakteryzują się między innymi wysoką aktywnością antywirusową.
Antymetabolity są związki włączające się w metabolizm wirusów i wywołujące zmiany w kodzie genetycznym RNA wirusowego hamujące ich namnażanie się.
Chemioterapia
Do antymetabolitów stosowanych w chemoterapii chorób wirusowych należą między innymi:
A) analogi pirymidyn np.uracyl
B) analogi puryn – np.chloramfenikol
C) surfaktanty np.bromek dodecylo-N- metyloefedryny
Termoterapia
Termoterapia – pod wpływem długotrwałego działania podwyższona temperaturą następuje inaktywacja termolabilnych wirusów w tkankach roślinnych.
Warunki traktowania to :
Temperatura 26-45oC
Czas traktowania 4 tygodnie do 3 miesięcy
Krioterapia
Krioterapia – polega na eliminowaniu chorób wirusowych poprzez mrożenie.
Należy jednak pamiętać że:
Większość wirusów toleruje niskie temperatury podczas krioprezerwacji.
Tylko niewielka ilość wirusów roślinnych termolabilnych może być usuwana poprzez mrożenie np. wirus szarki śliwy
Pobieranie merystemów wierzchołkowych
Pobieranie małych wycinków merystemu wierzchołkowego rzędu 0,1-0,3 mm powoduje zmniejszenie prawdopodobieństwa znalezienia się na nim cząsteczek wirusa.
Powoduje to jednak znaczne osłabienie przeżywalności merystemu
Sterylizacja komory do szczepień i narzędzi
1. Sterylizacja komory alkoholem etylowym
2. Sterylizacja komory lampą bakteriologiczną.
3. Sterylizacja szalek Petriego w suszarce w temperaturze 105oC.
4. Wyłączenie lampy baktriologicznej i załączenie nawiewu sterylnego powietrza oraz oświetlenia wnętrza.
5. Wysterylizowanie narzędzi (skalpeli, pincet i nożyczek) w autoklawie.
6. Włożenie narzędzi do zlewek z alkoholem.
7. Opalanie narzędzi przed użyciem nad palnikiem alkoholowym.
8. Odłożenie wysterylizowanych narzędzi na statyw w celu ostudzenia.
9. Po użyciu narzędzia włożyć do alkoholu w zlewce i ponownie opalić.
Sterylizacja materiału
Przebiega ona zwykle w trzech etapach:
1. oczyszczenie fragmentu roślinnego ze starych i obumarłych części i zanurzenie go prze około 0,5-10 sekund w 70-96% roztworu etanolu. Ma to na celu także odtłuszczenie i odpowietrzenie powierzchni co zapewni lepszy dostęp środkom sterylizującym.
2. szybkie przemieszczenie fragmentu roślinnego na określony czas do roztworu odkażającego. Można tu także dodać zwilżacza czyli związku zmniejszającego napięcie powierzchniowe co ułatwia kontakt związku chemicznego z odkażaną powierzchnią. Stosujemy tutaj Tween 20, FF lub Kokosal.
3. trzykrotne płukanie w sterylnej wodzie destylowanej . Pierwsze jest na ogół krótsze dwa następne dłuższe.
Po sterylizacji wycinek wyszczepia się na wcześniej przygotowaną i wysterylizowaną pożywkę.
Sterylizacja materiału
Ad.1. Po oczyszczeniu fragmentu rośliny ze starych i obumarłych części zanurza się go w alkoholu.
Polecane jest zanurzenie raczej w alkoholu 70% niż 96%.
96% alkohol jest mniej skuteczny przeciwko drobnoustrojom
Sterylizacja materiału
Ad.2. Fragment roślinny przenosi się sterylną pincetą na odpowiedni okres do właściwego odczynnika sterylizującego (sterylizatora).
Zwilżacz (Tween 20, Kokosal, FF, inny detergent) zmniejszając napięcie powierzchniowe na tkance ułatwia kontakt sterylizatora z cała odkażaną powierzchnią.
Sterylizacja materiału
Ad 3. Płukanie odbywa się w wodzie redestylowanej i autoklawowanej ma na celu usunięcie sterylizatora z powierzchni sterylizowanej tkanki aby regenerujący się fragment nie stykał się z nim.
Koncentracja sterylizatora zmniejsza się w miarę przenoszenia sterylizowanego materiału do kolejnej zlewki z wodą.
Sterylizacja materiału (sterylizatory)
Do sterylizacji stosujemy najczęściej:
podchlorynu sodu (NaOCl)
podchloryn wapnia
podchloryn potasu
chloramina T
dwuchloroamina
8-hydroksycholina
nadtlenek wodoru (woda utleniona)
chlorek rtęci
woda bromowa
antybiotyki
Sterylizacja materiału (sterylizatory)
Do sterylizacji stosujemy najczęściej:
podchlorynu sodu (NaOCl) popularna bielinka używana w gospodarstwie domowym zawiera jako substancję czynną podchloryn sodu, a także możemy stosować podchloryn wapnia lub potasu.
Związki te stosowane są w stężeniach 1-6% przez 5-30 minut.
Sterylizatory
Do sterylizacji stosujemy najczęściej cd:
chloramina T lub dwuchloroamina – roztwór 6% przez 5-30 minut.
8-hydroksycholina – roztwór 0,5-1%.
nadtlenek wodoru (woda utleniona) – roztwór 10-15% przez 3-15 minut.
chlorek rtęci – sublimat o stężeniu 0,01 – 0,5% przez 1 –12 minut.
woda bromowa – roztwór 1-2% przez 3-15 minut.
antybiotyki – np. penicylina 4 mg/dcm3, aureomycyna 50cm3/dm3, achromycyna.
Sterylizatory
Podchloryn sodu (nazwa systematyczna: chloran(I) sodu, NaClO) - nieorganiczny związek chemiczny, sól sodowa kwasu podchlorawego (chlorowego(I)).
Związek ten jest trwały tylko w roztworach wodnych.
Jest substancją odkażającą (np. wodę w basenach), ponieważ wykazuje silne właściwości utleniające.
Otrzymuje się go najczęściej nasycając chlorem roztwór wodorotlenku sodu.
Jest składnikiem czynnym wielu wybielaczy.
Stosowany do dezynfekcji ujęć wody.
W stomatologii stosowany do przepłukiwania kanałów zębowych podczas leczenia endodontycznego (kanałowego).
Podchloryn wapnia
Podchloryn wapnia (potocznie wapno chlorowane) Ca(OCl)2 substancja stała koloru białego, o charakterystycznym zapachu chloru, higroskopijna.
Powstaje podczas przepuszczania gazowego chloru nad wodorotlenkiem wapnia (wapnem gaszonym).
Silny utleniacz w roztworach kwasowych, zasadowych i obojętnych wydziela gazowy chlor.
Stosuję się go do sporządzania roztworów dezynfekcyjnych (między innymi wody basenowej), do bielenia (również w przemyśle papierniczym i tekstylnym), odczynnik analityczny oraz do różnych syntez organicznych i nieorganicznych.
Miarą jego aktywności jest zawartość "chloru aktywnego".
Do dezynfekcji i bielenia stosuję się roztwór 0,2-0,3%.
Sterylizatory
Chloramina T [CH3C6H4SO2NCl]-Na+, jest środkiem dezynfekcyjnym o działaniu bakteriobójczym.
Przeznaczona jest do dezynfekcji powierzchni użytkowych, narzędzi, przedmiotów, urządzeń higieniczno-sanitarnych i innych, bielizny, rąk.
Działanie biobójcze preparatu spowodowane jest powolnym uwalnianiem się chloru z roztworów wodnych preparatu w kontakcie z kurzem, zanieczyszczeniami, wydzielinami.
Sterylizatory
Woda utleniona 3% wodny roztwór nadtlenku wodoru (30% roztwór nazwany jest perhydrolem).
(H2O2) używany m.in. do dezynfekcji (także do rozjaśniania włosów).
Szczególnie silnie niszcząco działa na bakterie beztlenowe (anaeroby).
Niszczące działanie na bakterie ma tlen (tzn. rodniki tlenowe posiadające jeden niesparowany elektron walencyjny), który wytwarza się na powierzchni skóry.
Duże lokalne stężenie rodników tlenowych ma niszczące działanie na większość mikroorganizmów.
Po połączeniu się dwóch rodników tlenowych powstaje zwykły tlen cząsteczkowy (O2), który nie ma tak dużego wpływu na drobnoustroje (na oksybionty właściwie nie ma żadnego).
Sterylizatory
Chlorek rtęci(I) (Hg2Cl2, nazwa zwyczajowa: kalomel gr. kalós = piękny + mėlas = czarny, dawniej: chlorek rtęciawy) – nieorganiczny związek chemiczny – sól kwasu solnego i rtęci na I stopniu utlenienia.
W temperaturze pokojowej jest to biała substancja krystaliczna, w przeciwieństwie do innych soli rtęci nietoksyczna dla ludzi, ale toksyczna dla niektórych zwierząt, nierozpuszczalna w wodzie.
Kalomel jest stosowany m.in. do wyrobu elektrod, do barwienia porcelany, jako środek ochrony roślin, dawniej w bardzo małych ilościach czasem jako środek przeczyszczający.
Sterylizatory
Woda bromowa - nasycony wodny roztwór bromu, barwy brunatnej.
Brom ma niewielką rozpuszczalność w wodzie, wynoszącą ok. 3,6 g/100 g.
Stosowana w laboratoriach i przemyśle jako utleniacz.
Przechowywana jest w naczyniach z ciemnego szkła, aby ograniczyć reakcję bromu z wodą.
Woda bromowa jest wykorzystywana w chemii organicznej do wykrywania węglowodorów nienasyconych i ich pochodnych, w reakcji przyłączenia bromu rozpuszczonego w wodzie do wielokrotnego wiązania, co powoduje odbarwienie wody bromowej.
Sterylizatory
Penicyliny, antybiotyki penicylinowe - szeroko stosowana grupa bakteriobójczych antybiotyków; najstarsza grupa antybiotyków β-laktanowych.
Penicylina to antybiotyk β-laktamowy otrzymywany przy użyciu pleśni Penicillium.
W swej strukturze chemicznej zawiera pierścień tiozolidynowy sprzężony z pierścieniem beta laktamowym. Przedstawicielami są: penicylina benzylowa, penicylina fenoksymetylowa.
Sterylizatory
Achromycyna, Achromycin, antybiotyk, jedna z handlowych nazw tetracykliny.
Aureomycyna, chlorocyklina - antybiotyk z grupy tetracyklin stosowany głównie miejscowo w zakażeniach ropnych skóry, w zakażeniach spojówek i rogówki jako środek odkażający.
Sterylizatory
Achromycyna, Achromycin, antybiotyk, jedna z handlowych nazw tetracykliny.
Tetracykliny, grupa antybiotyków mających podobną budowę chemiczną.
Rozróżniamy tetracykliny naturalne: tetracyklina (Achromycin), chlorotetracyklina (Aureomycin) i oksytetracyklina (Terramycin) oraz tetracykliny półsyntetyczne.
Tetracykliny cechuje szeroki zakres działania.
Ze względu na wzrastającą odporność bakterii na działanie tetracyklin znaczenie tej grupy leków zmalało.
Płukanie po sterylizacji
Płukanie w wodzie ma na celu usunięcie sterylizatora z powierzchni sterylizowanej tkanki aby regenerujący się fragment nie stykał się z nim.
Koncentracja sterylizatora zmniejsza się w miarę przenoszenia sterylizowanego materiału do kolejnej zlewki z wodą redestylowaną (autoklawowaną) używanej do płukania materiału
Po sterylizacji wycinek materiału roślinnego wyszczepia się na wcześniej przygotowaną i wysterylizowaną pożywkę.
Prekultury
W przypadku systemicznego zakażenia przez patogeny (bakterie, grzyby) kontynuuje się dezynfekcje w hodowli wstępnej (prekultury), w których zachodzi wyeliminowanie patogenu poprzez wyłożenie na pożywkę zawierająca antybiotyki lub fungicydy.
Czynności wykonywane są na stole z ciągłym nawiewem filtrowanego, sterylnego powietrza.
Wyszczepianie lub wszczepianie
Wyszczepianie jest to proces przeniesienia wysterylizowanego fragmentu roślinnego (lub nawet pojedynczej komórki czy grupy komórek) na wysterylizowaną (wyjałowiona) pożywkę.
Pasażowanie
Pasażowanie jest to proces przeniesienia rośliny lub fragmentu roślinnego rosnącego w kulturze in vitro na świeżą wysterylizowaną pożywkę.
Sterylizacja szkła i narzędzi
Sprzęt laboratoryjny używany w kulturach in vitro:
– probówki
– kolbki stożkowe
– płytki Petriego
– słoiki
Sterylizacja szkła i narzędzi
– sucha sterylizacja w suszarce 2-3 godz. 160°C;
– sterylizacja parą wodną pod ciśnieniem w autoklawie, 30 min, 121°C;
– narzędzia w elektrycznej wyparzarce 800oC, lub zanurzając w 95% etanolu i opalając lampką spirytusową.
Wzrost
i rozwój w kulturach
in vitro przeniesienie do warunków
hodowlanych i hodowla
Warunki wzrostu w kulturach in vitro
Wymagania świetlne odnośnie wzrostu w kulturach in vitro
Wymagania świetlne:
Natężenie oświetlenia (światła)
Widmo światła (długość fali świetlnej)
Fotoperiod (czas ekspozycji)
Wymagania świetlne odnośnie wzrostu w kulturach in vitro
Oświetlenie:
Długość fali świetlnej – długości fali w zakresie 400-700 nm (światło fotosyntetycznie aktywne).
Indukuje ono syntezę chlorofilu i rozwój chloroplastów oraz formowanie pędów przybyszowych z komórek kalusa;
Natężenie światła – około 10 razy niższe niż w warunkach naturalnych, zakres 40-60 μmol/m²s, co odpowiada 5000-8000 luksów, moc 8-15W/m³;
Czas ekspozycji – długość dnia najczęściej 16h/dobę, zmienność nocy i dnia (fotoperiod).
Niektóre rodzaje kultur lub fazy (indukcja i proliferacja kalusa, rozwój korzeni przybyszowych) prowadzi się w ciemności
Warunki wzrostu
Wymagania świetlne.
Natężenie oświetlenia - zależy od stadium rozwojowego tkanki i stopnia jej samożywności.
Niezróżnicowane tkanki wymagają mniejszej intensywności (ok.500 lx) natomiast przed wsadzeniem do ziemi większej (ok.10 000 lx).
Widmo światła – światło niebieskie i ultrafiolet wpływają lepiej na inicjowanie różnicowania pędów. Światło czerwone sprzyja ukorzenianiu.
Fotoperiod – do zainicjowania organogenezy przypuszczalnie niezbędne jest 12-16 godzinne oświetlenie. Tym niemniej różne kultury wymagają różnych fotoperiodów.
Natężenie światła i jego skład spektralny
Natężenie światła i jego skład spektralny
Optimum natężenia światła wynosi 1000-3000 lux (luksów)
Niższe natężenie światła opóźnia wzrost eksplantatów i powoduje chlorozy.
Lampy fluorescencyjne stanowią światło szczególnie wskazane, odznaczające się wysoką emisja światła w paśmie czerwieni i błękitu.
Ultrafiolet stymuluje powstawanie pąków lub tkanki kalusowej
Zachowanie cyklów dobowych przy 16 godzinnym periodzie sprzyja formowaniu się korzeni i pąków przez większość gatunków roślin;
Niekiedy (w szczególnych przypadkach) zauważono korzystny wpływ zaciemnienia hodowli na przebieg organogenezy np. Fressia, Lilium
Natężenie oświetlenia
Natężenie oświetlenia które powinniśmy zastosować zależy od:
Stadium rozwoju tkanki
Stopnia samożywności tkanki
Natężenie oświetlenia
Przykłady:
Kultury kalusa można trzymać w całkowitej ciemności
Niektóre kultury prowadzi się przez pewien okres w mroku a dopiero po pewnym czasie wystawia na światło ponieważ światło zwiększa utlenienie związków fenolowych (wywołuje to zjawisko brunatnienia eksplantatów a w konsekwencji także ich zamieranie).
Natężenie oświetlenia
Kulturom zarodków i kulturom protoplastów w początkowym okresie hodowli wystarcza natężenie światła 500 – 1000 luksów po czym zapotrzebowanie na światło wzrasta.
Inicjowanie wzrostu tkanki i organogeneza wymaga większego natężenia światła rzędu 1000 – 3000 luksów.
Przygotowanie roślin do przesadzenia do gleby powinno łączyć się ze zwiększeniem natężenia światła od 3000 – 10000 luksów
Natężenie oświetlenia a rodzaje lamp
Widmo światła
Widmo światła
Jakość światła (widmo) wpływa na wzrost i rozwój tkanek roślinnych.
Światło niebieskie i bliski ultrafiolet wpływa na inicjowanie różnicowania pędów.
Światło czerwone sprzyja ukorzenianiu.
Promieniowanie czerwone sprzyja tworzeniu pąków.
Czerwone światło fluorescencyjne lub mało intensywne światło białe sprzyja rozwojowi roślinek w kulturach pylników.
Widmo światła
Fotoperiod
W większości wypadków wymagania co do długości dnia w kulturach tkankowych różnią się od fotoperiodu tych samych roślin rosnących w warunkach upraw polowych.
Istotne wydaje się być współdziałanie natężenia światła, czasu jego działania i właściwości samych eksplantatów.
Fotoperiod
Przykłady:
Kultury kalusa nie wymagają oświetlenia.
Tkanka taka w warunkach braku światła dobrze rośnie przez długi czas i nie zielenieje.
Do zainicjowania organogenezy niezbędne jest 12 – 16 godzinne oświetlenie.
Niektóre odmiany zbóż wymagają do wzrostu w kulturach in vitro 9 -11 godzinnego oświetlenia.
Protokormy wielu storczyków wymagają ciągłego oświetlenia.
Protokorm
protokorm [protocorm] – stadium w rozwoju zarodka, w którym nie posiada on tkanek zróżnicowanych na stożek wzrostu pędu, hipokotyl czy też zawiązek korzenia.
Temperatura (warunki cieplne)
Wymagania temperaturowe w kulturach in vitro zależą od:
gatunku,
rodzaju eksplantatu,
etapu prowadzonej kultury
Jest dobierana eksperymentalnie;
- temperatura wewnętrzna naczynia hodowlanego jest zwykle o kilka stopni wyższa niż temp. pomieszczenia.;
- rośliny lepiej reagują na temp. nieznacznie obniżoną niż podwyższoną w stosunku do swojego optimum.
Temperatura (warunki cieplne)
Temperatura:
- większość kultur wymaga do wzrostu temperatury 17-27°C ;
temperatura optymalna 24-26°C; (rośliny tropikalne ok. 32°C);
Warunki cieplne
Dotychczasowe badania pozwalają stwierdzić że:
niektóre gatunki roślin wymagają sezonowych zmian temperatury.
niektóre gatunki roślin wymagają temperatury stałej.
Wymagania wzrostu
Wymagania cieplne.
Wydaje się, że stała temperatura może sprzyjać rozwojowi roślin jednorocznych i tropikalnych (np. 25-300C cytrusowe i kawa) natomiast tkanki roślin trwałych strefy umiarkowanej i pustynnej wymagają prawdopodobnie określonych zmian temperatury (np. zarodki jęczmienia początkowo wymagają 180C a po osiągnięciu pewnego stadium rozwojowego 20-220C).
Wymagania cieplne
Tkanki roślin cytrusowych i kawy wymagają temperatury 25 -30oC.
Merystemy truskawki dobrze regenerują w temperaturze 25oC a źle w temperaturze 19oC.
Eksplantaty begonii tworzą pędy w temperaturze 18-21oC a w temperaturze 24oC proces ten jest zahamowany.
Fragmenty roślin cebulowych regenerują w temperaturze 12 -15oC.
Wymagania cieplne
Niektóre kultury wymagają jednoczesnej zmiany temperatury i długości dnia w zależności od stadium rozwoju.
Np. kultury in vitro zarodków jęczmienia:
na początku wymagają 18oC temperatury i pełnej ciemności
po osiągnięciu pewnego wstępnego stopnia rozwoju wymagają 20 -22oC temperatury i 12 godzin światła.
Wymagania cieplne
Tkanki niektórych roślin długotrwale przetrzymywane w kulturach in vitro i przechodzące w nich okres spoczynku są przetrzymywane w jednakowej temperaturze.
Przeniesienie ich do niższej temperatury może przerwać stan spoczynku.
Wymagania cieplne
Przestrzeganie zakresu odpowiednich temperatur jest warunkiem powodzenia kultur in vitro
Wilgotność
Wilgotność w kulturach in vitro:
Wilgotność względna – zawartość pary wodnej w fazie gazowej naczynia, w którym jest prowadzona kultura (ponad powierzchnia pożywki)
Wilgotność względna zależy od:
– temperatury - spadek temperatury, przy niezmienionej zawartości pary wodnej, powoduje spadek wilgotności względnej);
– składu chemicznego pożywki;
– wielkość eksplantatu (transpiracja) – jeżeli w dużym naczyniu znajduje się jeden mały eksplantat, to wilgotność gwałtownie obniża się, lepiej kiedy w naczyniu jest jeden duży eksplantat lub kilka małych)
Wilgotność
Gdy pożywka i „atmosfera” w naczyniu mają taką sama temperaturę, a naczynie jest szczelnie zamknięte, wówczas wilgotność względna teoretycznie wynosi 98-99%.
Należy zwrócić uwagę na to, że:
– ze względu na nieszczelność pojemników następuje ucieczka pary wodnej na zewnątrz – (plastikowe nakrętki wilgotność względna -80%, korki z waty -70%)
– ponieważ trudno jest ustalać wilgotność względną dla każdego naczynia, zaleca się aby określić ją dla pomieszczenia
– najbardziej odpowiednia dla eksplantatów jest wilgotność względna w pomieszczeniu rzędu 70%.
Atmosfera w kulturach in vitro
Tlen i dwutlenek węgla:
– zawartość tlenu w powietrzu wynosi zwykle około 21 %, a dwutlenku węgla około 0,036%
W naczyniu hodowlanym in vitro stężenie tych gazów zależy od:
– wielkości eksplantatu (jego intensywności oddychania, fotosyntezy, transpiracji);
– składu podłoża (zawartości węglowodanów);
– światła;
– temperatury;
– wielkości i kształtu naczynia.
Atmosfera w kulturach in vitro
Najkorzystniejsze jest utrzymanie stężenia tlenu w zakresie 60-70%.
Takie stężenie tlenu wywołuje:
intensywne podziały komórkowe,
wzrost ilości kalusa,
wzrost ilości pędów przybyszowych
wzrost zarodków somatycznych.
Tlen i dwutlenek węgla
Niższe niż w powietrzu stężenie tlenu ogólnie hamuje procesy rozwojowe.
Nawet korzenie, które zazwyczaj rosną w warunkach niedostatku tlenu, na pożywce rozwijają się intensywniej przy dobrym zaopatrzeniu w tlen.
Tlen i dwutlenek węgla
Prawdopodobnie w początkowym okresie wzrostu eksplantaty mają ograniczona zdolność do przeprowadzania procesu fotosyntezy.
Jednak w dalszym okresie wzrostu odpowiednie stężenie dwutlenku węgla warunkuje prawidłowy przebieg fotosyntezy.
Tlen i dwutlenek węgla
Wykazano, że wyższe niż w powietrzu stężenie tego gazu (1-5%) działa stymulująco na eksplantaty:
przyspiesza natężenie fotosyntezy,
przyspiesza tempo namnażania komórek w zawiesinie
przyspiesza proliferację kalusa,
powstaje więcej pędów bocznych.