Kultury in vitro
Rodzaje
Definicja
Kultury in vitro są to hodowle roślin, części roślin, tkanek lub pojedynczych komórek na sztucznych pożywkach w jałowych warunkach.
Cele hodowli in vitro
Dlaczego hodujemy w warunkach in vitro:
uniezależnienie się od pory roku
określanie i regulowanie warunków hodowli,
selekcjonowanie linii o podwyższonej odporności na herbicydy, pestycydy i inne środki ochrony roślin, co jest znacznie tańsze niż selekcja w warunkach polowych,
badanie procesów fizjologicznych takich jak reakcja na stresy, komunikacja międzykomórkową, sekrecja różnych związków do środowiska.
otrzymywanie nowych, korzystnych dla człowieka genotypów roślin
Rodzaje kultur in vitro
Wyróżniamy następujące rodzaje kultur in vitro:
kultury kalusa,
kultury zawiesinowe (zawiesin komórkowych),
kultury pojedynczych komórek,
kultury protoplastów,
kultury pylników i mikrospor,
kultury zarodków,
kultury fragmentów roślin (organów roślinnych),
Rodzaje kultur in vitro ze względu na rodzaj użytego eksplantatu
Kalus
Kalus jest to stale dzieląca się, niezorganizowana tkanka mająca wygląd bezpostaciowej masy (np. tkanka przyranna).
Powstaje między innymi z kambium, rdzenia, łyka wtórnego, miękiszu drzewnego, i wielu innych tkanek.
Kalus
Kalus, kallus, merystem przyranny - tkanka roślinna powstająca w miejscu zranienia rośliny najczęściej z okolicznych komórek tkanki miękiszowej.
Jest to amorficzna masa komórek mająca zwykle postać białego nalotu.
Komórki tworzone przez te merystemy powodują stopniowe zabliźnianie się i zarastanie ran.
Komórki kallusa są zwykle większe od komórek tkanki macierzystej.
Kalus
Kalus stanowi bezkształtną masę niezróżnicowanych i szybko dzielących się komórek.
Może być wyprowadzony z prawie każdej tkanki roślinnej poprzez traktowanie jej mieszaniną hormonów roślinnych (auksyn i cytokinin w takim samym stężeniu).
Tak wytworzony kalus w zależności od warunków w jakich się będzie rozwijać (tj. stężenia hormonów) może ulec ponownemu zróżnicowaniu w kierunku pędów lub korzeni, włącznie z odtworzeniem całej rośliny.
Hodowle in vitro kalusa znajdują szerokie zastosowanie w badaniach nad fizjologią i genetyką roślin.
Kultury kalusa
Pożywka do wzrostu kalusa powinna zawierać sole mineralne, witaminy, aminokwasy, cukry i substancje wzrostowe.
Kalus ma wiele postaci różniących się wyglądem zewnętrznym, zwięzłością, budową komórek.
Utrzymanie jego ciągłego wzrostu w kulturach in vitro wymaga przeszczepiania go na świeżą pożywkę w stałych odstępach czasu.
Po pierwszych kilku przeszczepieniach duża część nowych kultur zamiera a następnie po dalszych przeszczepieniach ilość zamierających klonów zmniejsza się i ustala na stałym poziomie.
Dopiero wtedy możemy mówić o ustanowieniu trwałej hodowli tkanek kalusa.
Długotrwałe utrzymanie kalusa w kulturach in vitro zmienia często stopień ploidalności. Niekiedy pojawiają się fragmenty tkanek w kalusie (np. przewodzących). Zależy to głównie od stosunku auksyn do cukrów w pożywce.
Kultury kalusa
Gdzie stosować kultury kalusa
Kultury kalusa mogą być źródłem:
materiału do kultur zawiesinowych komórek i agregatów komórek,
komórek do kultur pojedynczych komórek,
komórek dla kultur protoplastów,
materiału do regeneracji innych organów i całej rośliny po umieszczeniu w odpowiednich warunkach.
Czym się charakteryzują kultury kalusa
Rośliny zregenerowane z kalusa wykazują często wiele cech odmiennych od rośliny macierzystej stąd nie wszystkie nadają się do masowego mnożenia.
Są one jednak przedmiotem badań genetycznych i hodowli mutacyjnej.
Czym się charakteryzują kultury kalusa
Z niektórych komórek wegetatywnych kalusa można doprowadzić do wytworzenia bez zapłodnienia niby zarodków (tzw. somatyczna embriogeneza) tylko dzięki doborowi odpowiednich ilości substancji wzrostowych i azotu mineralnego.
Kultury kalusa tkanek rakowych dostarczają materiału do badań porównawczych rozwoju komórek naroślowych (rakowych) i normalnych.
Kultury kalusa ułatwiają również badania pasożytów roślinnych i ich zależności od tkanek gospodarza.
Kultury zawiesinowe

Kultury zawiesinowe komórek umożliwiają badania wzrostu i różnicowania się. Można je również używać do zregenerowania całych roślin.

Możemy je podzielić na dwie grupy:
A. Kultury statyczne.
B. Kultury ciągłe
Kultury zawiesinowe
A. Kultury statyczne – są to takie kultury, które mają określony czas trwania, ponieważ po pewnym czasie składniki odżywcze w pożywce zostaną wyczerpane a zgromadzą się produkty przemiany materii komórek.
Kultury zawiesinowe statyczne – szybkość wzrostu komórek
Kultury zawiesinowe
B. Kultury ciągłe – są to takie kultury, które mają zapewniony przepływ nowej pożywki i stałe odbieranie narastającej ilości komórek.
Naczynie jest połączone odpowiednio z dopływem pożywki i powietrza.
Takie rozwiązanie umożliwia również pobieranie, co pewien czas próbek do badań bez wpływu na sterylność.
Zaletą tego systemu jest utrzymanie komórek w określonej fazie wzrostu, co pozwala na badanie wielu zjawisk fizjologicznych w badanej fazie.
Kultury zawiesinowe
Możemy wyróżnić 4 główne grupy metod utrzymywania statycznych kultur zawiesinowych:
a) Metoda wolnoobrotowa
b) Metoda wstrząsania
c) Metoda kultur wirowanych
d) Metoda kultur mieszanych
Kultury zawiesinowe
a) Metoda wolnoobrotowa – komórki kalusa są mieszane w specjalnym naczyniu z wyrostkami.
Naczynie jest umieszczone na płycie wolnoobracającej się.
Ruch płyty powoduje kąpanie się tkanek w ciągle napowietrzanej pożywce.
Kultura zawiesinowa komórek w naczyniu Stewarda
Kultury zawiesinowe
b) Metoda wstrząsania – kolby Erlenmayera umieszcza się na platformie obracającej się ze stałą prędkością 60-180 obrotów/ minutę.
Urządzenie mimośrodowe powoduje także wstrząsanie zawartości i przewietrzanie pożywki.
Kultury zawiesinowe na wstrząsarce mimośrodowej
Kultury zawiesinowe
c) Metoda kultur wirowanych – specjalny słój jest umieszczony na obracającej się ramie, która powoduje ruch wirowy naczynia.
Urządzenie jest lekko nachylone względem pionu, co zapewnia lepsze mieszanie się zawiesiny komórek.
Kultury zawiesinowe na urządzeniu z wirującym słojem
Kultury zawiesinowe
d) Metoda kultur mieszanych – w tej metodzie samo naczynie tkwi w miejscu a mieszanie pożywki z zawiesiną komórek odbywa się za pomocą mieszadła magnetycznego wewnątrz naczynia szklanego.
Dzięki temu w tej metodzie możemy zastosować podgrzewanie zewnętrzne lub grzałkę wewnątrz zawiesiny.
Czym się charakteryzują kultury zawiesinowe
Obserwujemy w tych wszystkich metodach podobny rytm wzrostu komórek.
Początkowo komórki dzielą się wolno, najszybciej ulegają podziałom w 7 dniu po przeniesieniu do świeżej pożywki, a po 3 tygodniach podziały całkowicie ustają.
Trzeba więc wymienić pożywkę i zacząć namnażanie od początku
Kultury pojedynczych komórek
Metoda ta pozwala na otrzymanie klonu, pochodzącego od jednej, wyodrębnionej komórki, co umożliwia badanie morfogenezy w kulturach pochodzących z jednej komórki
Kultury pojedynczych komórek
Wyróżnia się tutaj następujące metody hodowli:
A) na „tratwie” z bibuły filtracyjnej
B) w wiszącej kropli
C) w mikrokamerze.
D) metoda płytek lanych.
Kultury pojedynczych komórek
Wyróżnia się tutaj następujące metody hodowli:
A) na „tratwie” z bibuły filtracyjnej – sterylne kwadraciki z bibuły filtracyjnej (8x8 mm) umieszcza się na wierzchołku kalusa, z którego będzie pobierana komórka.
Bibuła nasiąka roztworem pożywki i metabolitów kalusa.
Następnie na takiej aktywnej „tratwie” umieszcza się pojedynczą komórkę, która dzieli się i wytwarza kolonie nowych komórek
Hodowla pojedynczej komórki na „tratwie z bibuły” (1- tkanka macierzysta, 2-bibuła filtracyjna, 3- pojedyncza komórka i tworzący się kalus
Kultury pojedynczych komórek
B) w wiszącej kropli – pobieramy kroplę pożywki wraz z komórkami i umieszczamy je na szkiełku nakrywkowym od dołu.
W szkiełku przedmiotowym (podstawowym) robimy specjalne wyżłobienie, w które wejdzie pobrana kropla. Brzegi szkiełek uszczelniamy parafiną.
Kultury pojedynczych komórek
C) w mikrokamerze – kropla pożywki z komórkami umieszczana jest na szkiełku przedmiotowym (podstawowym).
Z boków a następnie z góry przykrywamy ja szkiełkami nakrywkowymi tworzącymi „mikrokamerę”.
Boki uszczelniamy parafiną.
Kultura pojedynczych komórek w mikrokamerze
Kultury pojedynczych komórek
D) metoda płytek lanych – z wyjściowej kultury zawiesinowej izoluje się pojedyncze komórki.
Pobraną mieszaninę wprowadza się do przestudzonego, ale płynnego jeszcze agaru i rozprowadza na szalce milimetrową warstwą.
W warstwie tej tworzą się kolonie.
Zalety kultur pojedynczych komórek
Kultury pojedynczych komórek pozwalają na:
a) badanie submikroskopowej struktury komórek,
b) badanie ich procesów życiowych (wzrostu, różnicowania, metabolizmu),
c) umożliwiają obserwację współzależności patogenów i żywicieli.
Protoplasty
Protoplasty roślinne
Protoplast jest to komórka roślinna pozbawiona ściany komórkowej.
Ściana usunięta zostaje za pomocą enzymów celulotitycznych oraz protelotycznych.
Bardzo istotne jest, aby w procesie enzymatycznego usuwania ścian komórkowych jak najwięcej komórek przeżywało. Nie bez znaczenia jest również tzw. wigor.
Materiał używany do izolacji protoplastów pochodzi najczęściej z kultur in vitro.
Skład roztworu, który używany jest do izolacji protoplastów może być różny w zależności od tego skąd pobieramy komórki, jaki to gatunek rośliny itp.
Protoplasty
Skład roztworu, który używany jest do izolacji protoplastów:
musi zawierać enzymy,
regulator ciśnienia osmotycznego (najczęściej są to roztwory cukrów)
sole mineralne.
Tuż po zakończonej inkubacji w roztworach zawierających enzymy zawiesinę komórek należy przefiltrować zachowując warunki aseptyczne.
Następnie zawiesinę wiruje się w roztworze, którego głównym składnikiem jest również cukier – najczęściej sacharoza.
Protoplasty pływają po powierzchni, natomiast martwe komórki oraz fragmenty tkanek opadają do supernatantu lub tworzą osad.

Protoplasty
Protoplasty umieszcza się następnie w pożywce płynnej lub zestalonej agarozą zawierającej poza standardowymi składnikami również regulatory wzrostu.
Wtedy też następuje proces regeneracji ściany komórkowej.
Kolejnym etapem jest indukcja podziałów komórkowych.
Zachodzić one mogą już po 2 dniach od założenia kultury.
Komórki, które otoczone są już ścianą komórkową nie wymagają podwyższonego ciśnienia osmotycznego. Dlatego też zmienia się skład pożywki tak, aby przywrócić komórkom turgor.
Ostatnim etapem kultury jest regeneracja roślin. Żeby do niej doszło należy utworzone agregaty protoplastów przenieść z poprzedniej pożywki na nową, o innym uboższym składzie. Najczęściej regeneracja roślin kończy się minimum 2 miesiące od początku izolacji.
Protoplasty
Protoplasty roślinne
Fuzja protoplastów
Celem przeprowadzania fuzji protoplastów, czy to roślinnych czy zwierzęcych, jest chęć uzyskania nowych kombinacji jądrowych, cytoplazmatycznych oraz jądrowo-cytoplazmatycznych.
A. Chemiczna fuzja protoplastów
W metodzie tej wykorzystuje się glikol polietylenowy, który w obecności jonów Ca stymuluje fuzję. Wykorzystywany jest glikol polietylenowy o masie do 8 kDA. Stosuje się również modyfikację tej metody z zastosowaniem DMSO.
B. Elektrofuzja
Protoplasty układają się wzdłuż pola elektrycznego w wyniku przepływu prądu elektrycznego o częstotliwości 0,5-4 MHz oraz natężeniu do 500 V/cm. Następnie krótki impuls elektryczny prądu stałego powoduje łączenie się sąsiadujących ze sobą protoplastów(elektroporacja błon protoplastów).
Pojęcia:
Karioplasty – protoplasty posiadające jądra komórkowe oraz minimalną liczbę organelli
Cytoplasty – protoplasty pozbawione jądra komórkowego
Mieszańce somatyczne – rośliny lub komórki uz
Kultury protoplastów
Komórka pozbawiona ściany komórkowej stanowi protoplast.
Wolny protoplast przybiera kształt zbliżony do kulistego.
Źródłem protoplastów są najczęściej komórki mezofilu liścia i kultury zawiesinowe kalusa.
Ścian komórkowych możemy się pozbyć po zastosowaniu odpowiednich enzymów rozpuszczających ścianę komórkową komórek lekko splazmolizowanych.
Po uwolnieniu ze ściany komórkowej i odpowiednim przemyciu protoplasty umieszczane są w płynnej lub stałej pożywce rozlanej cienką warstwą na szalce Petriego lub hodowane mogą być w wiszącej kropli albo mikrokamerze.
Gdzie stosować kultury protoplastow
Kultury protoplastów stosować można do:
A) tworzenia całej rośliny,
B) tworzenia tkanki kalusowej,
C) fuzji protoplastów.
Zalety kultur protoplastów
Główną zaletą kultur protoplastów jest możliwość łączenia protoplastów komórek somatycznych odrębnych gatunków.
Fuzja taka daje żywotny protoplast heterokariotyczny, następuje regeneracja ściany komórkowej, zlanie jąder i utworzenie jednego genomu.
Umożliwia to powstanie nowego mieszańca.
Świadectwem powstania mieszańca jest ujawnianie się w zregenerowanym organizmie cech charakterystycznych dla każdego z gatunków rodzicielskich.
Kultury protoplastów dają nadzieję na olbrzymi postęp w inżynierii genetycznej.
Kultury pylników i mikrospor
Służą one do uzyskania roślin haploidalnych i linii homozygotycznych.
Pylniki powinny być pobrane z młodych roślin, w początkowej fazie kwitnienia, nie mogą one być uszkodzone.
Pylniki umieszcza się na pożywkach stałych.
Po kilku tygodniach wyrastają z nich roślinki, które oddziela się od pylnika i przesadza do sterylnej ziemi.
Można również stosować tutaj podobnie kultury izolowanych mikrospor i ich protoplastów.
Zapewniają one produkcje jednorodnego klonu haploidów.
Stosujemy je do badań nad mutacją i transformacją
Kultury pylników i mikrospor
Androgeneza
Androgeneza - proces rozwoju nowej rośliny z gametofitu męskiego.
Proces ten może być indukowany przez wyłożenie pylników lub izolowanych mikrospor na pożywkę wzrostową w warunkach in vitro.
Powstałe w ten sposób rośliny są najczęściej haploidalne – mają liczbę chromosomów charakterystyczną dla gamet.
Androgeneza
Androgeneza
ROZWÓJ PYŁKU IN VITRO
U roślin doświadczenia prowadzono między innymi na trawach.
Udowodniono że rozwój sporofityczny można pobudzić szokiem termicznym (wysoka temp.)
Na skutek szoku podział komórki zamiast asymetrycznego staje się symetryczny i tworzy się struktura wielokomórkowa.
Ściana komórkowa rozwija się dośrodkowo, powstają na skutek zaistniałych zdarzeń struktury wielokomórkowe.
Czynnikami wpływającymi na androgenezę jest genotyp (tylko pewne genotypy warunkują reakcję w kulturze In vitro).
Androgeneza
Warunki wzrostu roślin donorowych ziarn pyłku to:
fotoperiod w jakim rosną,
rośliny muszą być żywotne i zdrowe.
pożywka,
stadium rozwojowe mikrospory (musi być ona w formie jednojądrowej i zwakuolizowanej).
odpowiednia temperatura (25-30 stp. C),
zmiany natężenia światła,
odpowiednia gęstość posiewu.

Wyróżniamy dwie techniki androgenezy: kultury pylników (zarodek, kallus, roślina), kultury mikrospor (kwiatostan, posiew, filtracja…)
Można więc wyróżnić dwa sposoby regeneracji: regeneracja bezpośrednia tj. bez stadium kallusa, oraz regeneracja pośrednia, włączymy stadium kallusa do etapów regeneracyjnych.
Problemem gospodarczym jest fakt iż regeneraty są najczęściej sterylne, posiadają 1n chromosomów. Aby podwoić ich liczbę stosuje się środek chemiczny kolchicynę.
Androgeneza
Wyróżniamy dwie techniki androgenezy:
kultury pylników (zarodek, kallus, roślina),
kultury mikrospor (kwiatostan, posiew, filtracja…)
Można więc wyróżnić dwa sposoby regeneracji:
regeneracja bezpośrednia tj. bez stadium kallusa,
regeneracja pośrednia (włączymy stadium kallusa do etapów regeneracyjnych).
Problemem gospodarczym jest fakt iż regeneraty są najczęściej sterylne, posiadają 1n chromosomów. Aby podwoić ich liczbę stosuje się środek chemiczny kolchicynę.
Gynogeneza
Gynogeneza, pseudogamia - specyficzna odmiana partenogenezy polegająca na indukowaniu rozwoju jaja przez plemniki innego gatunku (bez wnikania plemnika do jaja)
Gynogeneza - proces rozwoju nowej rośliny z gametofitu żeńskiego bez wcześniejszego zapłodnienia. Może być indukowana przez wyłożenie izolowanych zalążni na pożywkę wzrostową w warunkach in vitro.
Gynogeneza
Gynogeneza
Wyróżniamy pieć mechanizmy przebiegu gynogenezy in vitro:
1. Pseudogamia i przedwczesna embriogeneza – zapłodniona zostaje tylko komórka centralna i rozwija się jedynie bielmo.
2. Apogamia, zapłodniona zostaje inna komórka niż komórka jajowa. U ryżu zapładniana jest synergia, a u cebuli antypoda.
3. Analiza embriologiczna – podstawowym procesem jest partenogeneza (czyli rozwój z nie zapłodnionej komórki jajowej). Ne rozwinie się bielmo natomiast komórka jajowa się powiększa i dzieli się asymetrycznie. Na skutek asymetrycznych podziałów otrzymujemy dużą komórkę bazalna i małą apikalna. Następnie komórki dzielą się podobnie jak In vivo.
4. Eliminacja chromosomów ojca. Jest to tzw. metoda BULBOSUM
5. Metody indukcji genetycznej.
Gynogeneza
PRZEBIEG PROCESU GYNOGENEZY IN VITRO
Zalążki wszczepiane są na pożywki i po pewnym czasie otrzymujemy kallus, lub małe roślinki. Najczęściej haploidalne ale nie zawsze.
Warunkami od których zależy przebieg procesu ginogenezy jest:
genotyp,
stadium w jakim znajduje się woreczek zalążkowy,
pożywka,
temperatura,
fotoperiod.

Otrzymane regeneraty mogą być:
jedynie haploidami, haploidami z koniecznością kolchicynowania, diploidami (konieczność przeprowadzania testów), miksoploidami.
Kolchicyna
Kolchicyna C22H25NO6) - organiczny związek chemiczny z grupy alkaloidów o silnie trującym działaniu.
Związek ten wykazuje różnorodne działania na organizmy żywe, głównie związane z oddziaływaniem na cytoszkielet.
Znany jest szczególnie ze zdolności do upośledzania segregacji chromosomów podczas podziału komórki co doprowadza do powstania komórek o zduplikowanym garniturze chromosomów.
W ten sposób daje się stosunkowo łatwo uzyskać rośliny poliploidalne, interesujące zarówno ze względów użytkowych jak i teoretycznych.
Zarodek
Zapylenie prowadzące do zapłodnienia może się odbyć poprzez własny pyłek jednakże zjawisko heterostylii ma za zadanie zapobiegać temu.
Pyłek zostaje przeniesiony na znamię słupka następuje jego uwodnienie i rozpoczyna się tworzenie łagiewki pyłkowej.
Łagiewka przenika przez znamię słupka, w której znajduje się tkanka transmisyjna posiadająca białka regulatorowe zawierające lipo i gliko proteiny warunkujące przeciskanie się łagiewki do zalążni.
Tam hemotropowe przyciąganie synergid oddziaływuje na łagiewkę.
Synergidy degradują gdy łagiewka dotrze w okolice łożyska, wydzielone zostaną dwie mikrospory, z których jedna zapłodni komórkę jajową, druga natomiast komórkę centralną.
Przy zapłodnieniu najpierw zleje się cytoplazma komórek (plazmogamia) następnie połączą się jądra (kariogamia).
Zarodek
Po zlaniu się jader możemy mówić o powstałej zygocie.
Zygota otacza się ścianą komórkową i zaczyna dzielić poprzecznie, prostopadle do swej dłuższej osi.
Najczęściej są to podziały asymetryczne, powstają dwie komórki jedna w części bazalnej, druga w apikalnej.
Twór ten zwany jest prazarodkiem, z którego w rezultacie intensywnych podziałów przy biegunie chalazalnym tworzy się właściwy zarodek.
Natomiast szereg nitkowatych komórek przy części mikropylnej tworzy wieszadełko.
Wieszadełko kończy się dużą uwypukloną komórką.
Natomiast zarodek właściwy u dwuliściennych przybiera kształt sercowaty (serce z powodu zawiązków dwóch liścieni), następnie tworzy się zawiązek korzenia radykula oraz część podliścieniowa hipokotyl.
Pomiędzy liścieniami utworzył się pąk wierzchołkowy plamula.
U jednoliściennych tworzy się zawiązek jednego liścienia, a pąk wierzchołkowy jest położony brzeżnie.
Somatyczna embriogeneza
ROZWÓJ ZARODKA I KOMÓREK SOMATYCZNYCH IN VITRO

Embriogeneza somatyczna jest to proces, w którym z komórki somatycznej (2n chromosomów) powstają zarodki przybyszowe.
Zarodek przybyszowy to taki który nie powstał z zygoty ale z komórek aseksualnych.
Embriogeneza somatyczna może być pośrednia tzn. z komórek najpierw należy uformować kallus, który powstaje na ekplantach, na nim zaś powstają dopiero prembriogeniczne masy komórek (PEM)
Z nich utworzy się zarodek.
Somatyczna embriogeneza
W embriogenezie somatycznej bezpośredniej zarodek tworzy się z zdeterminowanych komórek preembriogenicznych

Embriogeneza somatyczna jest możliwa dzięki pewnym właściwością komórek.

Totipotencji – zdolności do odtworzenia całego organizmu z pojedynczej komórki.

Kompetencji – zdolności komórek do odbioru sygnałów i reakcji na nie.

Konwersji – zdolność zarodka somatycznego do rozwoju i przekształcenia się w roślinę.
Somatyczna embrigeneza
Aby móc mówić o zarodku somatycznym muszą być spełnione założenia Macciu’sa:
a)     zarodek musi mieć strukturę dwubiegunową
b)     nie może być połączony wiązkami przewodzącymi z eksplantem
c)      biegun korzeniowy musi być zdefiniowany anatomicznie
Kultury zarodków
Izolowane zarodki umieszcza się na pożywce, której skład zależy od stadium rozwojowego zarodka.
Należy zwrócić uwagę na bazypetalne umieszczenie zarodka na pożywce, inne ułożenie sprzyja powstawaniu kalusa.
Kultury zarodków
Zarodek
Zarodek lub z greckiego embrion – osobnik roślinny lub zwierzęcy we wczesnym etapie rozwoju zwanym okresem zarodkowym.
Okres ten zaczyna się podziałem zygoty i u różnych organizmów kończy w różnym czasie.
Zarodek występuje u zwierząt wielokomórkowych produkujących gamety a więc począwszy od niektórych gąbek i jamochłonów natomiast, o zarodku wśród roślin mówimy począwszy od paprotników (u mszaków dorosłą rośliną jest gametofit a sporofit nigdy nie jest samodzielny).
Zarodek u dwuliściennych
a – osłonki
b- materiał zapasowy
c – liścienie
d- zawiazek rośliny
Zarodek u jednoliściennych
a – osłonki
b- materiał zapasowy
c – liścienie
d- zawiazek rośliny
Czemu służą kultury zarodków
Kultury zarodków służą dwóm celom:
A) na izolowanych zarodkach można badać zapotrzebowanie pokarmowe, procesy wzrostu i rozwoju,
B) izolowane zarodki pozwalają na uzyskanie roślin z krzyżowania systematycznie odległych gatunków oraz stymulowanie wzrostu i rozwoju wyizolowanych embrionów.
Kultury organów (fragmentów) roślinnych
Kultury fragmentów roślin
Kultury fragmentów roślin.
A) Kultury merystemów – merystemy wierzchołkowe wraz z dwoma zawiązkami przyległych liści i niewielkim fragmentem łodygi , po powierzchniowej ich sterylizacji, umieszcza się na pożywce stałej lub płynnej.
Skład pożywki i stopień jej zestalenia zależy od gatunku lub odmiany rośliny.
Merystemy wymagają dostarczania makroelementów, mikroelementów, cukrów, witamin i substancji wzrostowych.
Rosnące merystemy wytwarzają pędy lub kalus.
Należy więc dążyć do tworzenia takich warunków, które zmuszają merystemy do tworzenia pędów i korzeni.
Dzięki kulturom merystemów można uzyskać zdrowe rośliny i skracać czas rozmnażania.
Kultury merystemów
Kultury fragmentów roślin
B) Kultury korzeni – umożliwiają zbadanie właściwości fizjologicznych korzeni, poznanie ich wymagań pokarmowych, poznanie ich morfogenezy.
Do ich wzrostu potrzebne są sole mineralne, sacharoza i tiamina.
Kultury fragmentów roślin
C) Kultury organów spichrzowych – stosujemy tu kultury in vitro fragmentów cebul, pojedynczych lub podwójnych łusek, wycinków bulw, wycinków kłączy.
Stosujemy w celu podwyższenia współczynnika namnażania niektórych roślin cebulowych.
Kultury fragmentów roślin
D) Kultury łodyg – stosujemy je u roślin zielnych i drzewiastych.
Kultury wycinków łodyg lub szypułek kwiatowych mogą regenerować całe rośliny lub bulwocebule.
Kultury fragmentów roślin
E) Kultury liści – kultury in vitro wycinków liści wykorzystuje się do masowego namnażania roślin.
Liść lub jego część po odkażeniu umieszcza się na pożywce stałej lub płynnej.
Na ogół z wycinków wyrasta kalus, lecz odpowiednio dobrane warunki środowiska wywołują organogenezę, czyli wytworzenie pędów lub organów spoczynkowych
Kultury fragmentów roślin
F) Kultury kwiatostanów – niektóre rośliny można namnażać wywołując organogenezę w izolowanych kwiatostanach, kwiatach lub ich fragmentach.
W tym celu z kwiatostanów usuwa się płatki i działki kielicha i umieszcza na pożywce.
W sprzyjających warunkach z tkanek twórczych kwiatostanów wyrastają pędy, które po oddzieleniu ukorzeniają się.
Kultury fragmentów roślin
G) Kultury pąków i bocznych wierzchołków wzrostu – eksplantaty merystemów obejmują tutaj strefę merystematyczną i jeden bądź dwa zawiązki liścia.
Natomiast kultury pąków i wierzchołków wzrostu obejmują pąk wierzchołkowy i często zawiązki pąków bocznych.
Eksplantaty umieszczane na pożywce tworzą pędy i ukorzeniają się.
Jednakże z jednego pąka wyrasta tylko jedną roślinę a nie wiele jak to jest w przypadku innych kultur.
Mikrorozmnażanie
Komercyjne technologie masowego powielania materiału roślinnego oparte są głównie na metodzie mikrorozmnażania.
Mikrorozmnażanie (rozmnażanie klonalne) to wegetatywne rozmnażanie roślin w warunkach laboratoryjnych na sztucznych podłożach (w tzw. kulturach in vitro).
Mikrotrozmnażanie
Termin ten oznacza wykorzystanie hodowli in vitro do rozmnażania wegetatywnego roślin.
Cząstka wyrazu "mikro-" w nazwie tej techniki odnosi się jedynie do ilości wyjściowego materiału, natomiast liczba uzyskiwanych w ten sposób roślin potomnych może być bardzo duża.
Poza wysokim współczynnikiem rozmnażania (proporcją liczby roślin uzyskanych do wyjściowej liczby roślin użytych do rozmnażania) ogromną zaletą tej techniki jest duże wyrównanie fenotypowe i genotypowe produkowanych roślin (np. Anthurium andreanum, Anthurium scherzerianum, Gerbera jamesonii).
Mikrorozmnażanie
Hodowlę prowadzi się w ściśle kontrolowanych warunkach dzięki czemu materiał roślinny, odizolowany od środowiska zewnętrznego, jest wolny od patogenów i szkodników niezależnie od warunków geograficznych np. rozmnażając in vitro Chrysanthemum sp. uzyskuje się rośliny wolne od wirusa karłowatości złocienia, aspermii złocienia, wirusa B złocienia.
Mikrorozmnażanie
Mikrorozmnażania jest doskonałym rozwiązaniem w przypadku produkcji roślin, które trudno rozmnażają się wegetatywnie metodami tradycyjnymi.
Ponadto dzięki tej metodzie możliwa jest produkcja roślin, których nasiona są bardzo drogie, wolno kiełkujące lub mające szczególnie niską siłę kiełkowania.
Cykl hodowlany przy otrzymywaniu nowych odmian roślin może zostać skrócony o 3-4 lata, jak to było w przypadku Freesia, Gladiolus czy Fragaria x ananassa.
Mikrozmnażanie czy rozmnażanie klonalne
Rozmnażanie klonalne znalazło również zastosowanie przy zachowaniu linii męskosterylnych i utrzymywaniu wsobnych linii pochodnych mieszańców F1 u takich roślin jak: Brassica campestris, Alium cepa, Asparagus officinalis.
Materiał roślinny otrzymany w wyniku wegetatywnego rozmnażania można łatwo przechowywać w obniżonej temperaturze (nawet przez 2-5 lat), a także transportować jego duże ilości, co usprawnia międzynarodową wymianę materiału roślinnego (w paczce ważącej 15kg można umieścić około 40000 roślinek).
Mikrorozmnażanie (rozmnażanie klonalne)
Za pomocą mikrorozmnażania na świecie produkuje się rocznie ponad 800mln sztuk roślin, z czego 90% to rośliny ozdobne.
Wielkość rocznej produkcji roślin in vitro w różnych regionach świata:
Europa – 200 mln sztuk
Afryka – 46 mln sztuk
USA i Kanada – 110 mln sztuk
Ameryka środkowa – 155 mln sztuk
Australia i Nowa Zelandia – 85 mln sztuk
Izrael i Środkowy Wschód – 92 mln sztuk
Mikrorozmnażanie
W Polsce obecnie działa około 20 laboratoriów zajmujących się mikrorozmnażaniem, głównie roślin ozdobnych tj. gerbera, fikus, różanecznik, azalia, storczyk, fikus, zatrwian, lilia, chryzantema, gloksynia, goździk, paproć, alokazja, kalmia, primula, a także borówki wysokiej, truskawki, żurawiny i jeżyny.
MIkrorozmnażanie
Krajowa produkcja sadzonek in vitro jest jedną z największych w Europie i szacunkowo wynosi 70 – 100 mln sztuk na rok.
Eksportowane są do: Holandii, Anglii, Hiszpanii, Izraela, Węgier, Czech, Białorusi, Bułgarii, Turcji, USA oraz na Ukrainę, Litwę i Łotwę.
We Włoszech produkuje się głownie rośliny sadownicze np.: winorośl, brzoskwinie, a także podkładki dla aktinidii, moreli, jabłonie, orzecha włoskiego, gruszy, śliw.
Natomiast Belgia specjalizuję się w produkcji roślin drzewiastych (Rododendron).
Mikrorozmnażanie
Etapy mikrorozmnażania
Etap I - Założenie kultury
Etap II - Masowe namnażanie
Etap III - Adaptacja uzyskanych roślin do normalnych warunków
Następnie rośliny wysadza się do doniczek, wypełnionych substratem (np. mieszaniną ziemi, torfu i perlitu) i umieszcza w optymalnych warunkach.
Z chwilą przyjęcia się rośliny proces mikrorozmnażania zostaje zakończony.
Rozmnażanie klonalne roślin
Rozmnażanie klonalne roślin
Zdrowe i wolne od oznak chorób rośliny można rozmnażać wegetatywnie w kulturach in vitro uzyskując wysoki wskaźnik namnażania.
Wyróżnić tutaj możemy 3 zasadnicze etapy:
- ustanowienie jałowej kultury in vitro.
- masowe namnażanie roślin
- ukorzenianie roślin
Rozmnażanie klonalne roślin
Wyróżnić tutaj możemy 3 zasadnicze etapy:
- ustanowienie jałowej kultury in vitro – wybrany fragment rośliny umieszczony zostaje na pożywce. Kultury, które wykazują jakiekolwiek objawy porażenia zostają usunięte.
Założenie kultury
Etap I - Założenie kultury
Aby założyć kulturę należy wziąć pod uwagę kilka istotnych czynników, które determinują osiągnięcie jak najlepszej wydajności.
Założenie kultury
Wybierając eksplantat pierwotny warto zwrócić uwagę na:
wiek rośliny (młode, zdrowe, intensywnie rosnące rośliny są lepsze);
wybór organu roślinnego do pobrania eksplantatu (najłatwiej dalszy wzrost podejmują części roślin zawierające różnego rodzaju tkanki merystematyczne);
porę roku (okres wiosenny – najwyższa wydajność);
warunki wzrostu rośliny donorowej (optymalne warunki rozwoju, odpowiednie oświetlenie, temperatura, nawożenie);
stan fitosanitarny roślin.
Założenie kultury
Eksplantaty poddaje się sterylizacji, najczęściej wykorzystując do tego celu roztwory podchlorynu sodu, potasu lub wapnia, chloraminę T, chlorek rtęci, etanol, wodę utlenioną.
Ważne jest żeby czas sterylizacji nie był zbyt długi oraz stężenie substancji odkażającej zbyt wysokie, ponieważ może to wywołać zamieranie tkanek.
Założenie kultury
Po sterylizacji należy trzykrotnie wypłukać eksplantat w sterylnej wodzie.
Następnie materiał roślinny przenosi się na pożywki.
W ciągu 3-6 tygodni po wyłożeniu na pożywkę następuje tzw. stabilizacja hodowli, w efekcie której uzyskuje się aseptyczny i zdolny do namnażania eksplantat.
Na tym etapie selekcjonuje się materiał roślinny i odrzuca nieprawidłowo rozwinięty, nekrotyczny, zdeformowany i porażony.
Rozmnażanie klonalne roślin
Wyróżnić tutaj możemy 3 zasadnicze etapy:
- masowe namnażanie roślin – etap ten polega na okresowym dzieleniu i przenoszeniu na świeżą pożywkę namnożonego materiału roślinnego. Ma to na celu uzyskanie pożądanej ilości egzemplarzy.
Masowe namnażanie
Etap ten polega na powielaniu materiału roślinnego, dzielenie go i przenoszenia na świeże pożywki.
Trwa to aż do uzyskania pożądanej ilości egzemplarzy.
Masowe namnażanie
W tym okresie aseptyczny materiał roślinny (np.: zarodki somatyczne, pąki przybyszowe, pędy, wieloroślinki) zabezpiecza się przed drobnoustrojami poprzez stałą kontrolę powietrza w pomieszczeniach hodowlanych i testowanie sterylności komór laminarnych.
Masowe namnażanie
Długość pojedynczego pasażu wynosi od 3 do 8 tygodni i zależy od:
gatunku rośliny,
chemicznych warunków rozmnażania
fizycznych warunków rozmnażania.
Nie powinno się dopuścić starzenia się kultur ponieważ może to doprowadzić do obniżenia żywotności i zdolności do ukorzeniania w następnych pasażach.
Rozmnażanie klonalne roślin
Wyróżnić tutaj możemy 3 zasadnicze etapy:
ukorzenianie się - w ostatnim okresie pędy ukorzeniają się a inne otrzymane organy przechodzą właściwe im okresy spoczynku.
Trwa to około 1 miesiąca.
Adaptacja uzyskanych roślin do normalnych warunków
Przed przeniesieniem do warunków in vivo materiał roślinny hartuję się przez:
zmniejszenie poziomu cukrów w pożywce
obniżenie temperatury
zwiększenie natężenia światła w pomieszczeniach hodowlanych (fitotronach).
Adaptacja uzyskanych roślin do normalnych warunków
Właśnie wtedy uzyskane pędy zmuszane są do wytworzenia systemu korzeniowego, warstwy ochronnej tkanek oraz uruchomienia efektywnych procesów transpiracji i fotosyntezy.
Adaptacja uzyskanych roślin do normalnych warunków
Ukorzenianie przeprowadza się w zależności od gatunku rośliny:
- w warunkach in vitro – długość okresu ukorzeniania pędów na pożywkach o zredukowanej zawartości minerałów wynosi od 1-6 tygodni,
- w warunkach ex vitro – ukorzenianie pędów prowadzone w tych warunkach przebiega równocześnie z aklimatyzacją i wytwarzaniem nowych liści.
Adaptacja uzyskanych roślin do normalnych warunków
Następnie rośliny wysadza się do doniczek, wypełnionych substratem (np. mieszaniną ziemi, torfu i perlitu) i umieszcza w optymalnych warunkach.
Z chwilą przyjęcia się rośliny proces mikrorozmnażania zostaje zakończony.
Przygotowanie uzyskanych in vitro roślin do przeniesienia w warunki in vivo.
Pod koniec przyzwyczajamy rośliny do nowych warunków oświetlenia, temperatury i wilgotności wystawiając je w szklarni na działanie światła naturalnego i uchylając szczelne przykrycia.
Po krótkim okresie przygotowawczym można rośliny wysadzać do gruntu.
Sposoby mikrorozmnażania
Sposoby mikrorozmnażania:
- pobudzanie do rozwoju pąków bocznych
- formowanie pąków przybyszowych bezpośrednio lub pośrednio przez kalus
- embriogenezę somatyczną
Sposoby mikrorozmnażania
Najlepiej poznaną metodą jest ta pierwsza, choć wydajność reprodukcyjna tej metody jest ograniczona liczbą pąków na eksplantatach (2-20 pąków).
Dwa pozostałe charakteryzują się bardzo dobrą wydajnością rozmnażania, lecz szczegółowe protokoły są opracowane dla niewielu odmian.
Sposoby mikrorozmnażania
Kultury pąków bocznych
Najczęściej używanymi eksplantatami do inicjacji kultur in vitro pędów bocznych są:
merystemy wierzchołkowe,
merystemy pąków bocznych
wierzchołki pędów,
pąki kwiatowe (boczne),
fragmenty pędów z węzłem, parą liści i pąkiem bocznym.
Sposoby mikrorozmnażania - kultury pąków bocznych
Eksplantaty wykłada się na pożywki z dodatkiem cytokininy, umożliwiając rozwój już istniejących i tworzenie się nowych pąków kątowych.
Klony roślin uzyskane tą metodą są wyrównane fenotypowo i wykazują genetyczną stabilność.
Bardzo istotnym aspektem wykorzystania tej metody jest poprawienie zdrowotności roślin.
Kultury merystemów pozwalają otrzymać materiał roślinny wolny od patogenów, a zwłaszcza od wirusów.
Sposoby mikrorozmnażania - kultury pąków bocznych
Wykazano, że merystem wierzchołkowy pędu nie zawiera wirusów, bądź posiada ich niewiele i że traci je w trakcie kultury.
Często, w celu wydajniejszego procesu odwirusowania technikę mikrorozmnażania łączy się:
z termoterapią – traktowaniem materiału roślinnego podwyższona temperaturą in vivo (przed pobraniem eksplantatu, 26-45°C przez 4 do 12 tygodni) lub in vitro (30-36°C, przez 4 do 8 tygodni)
z chemioterapią – dodaniem do pożywek antymetabolitów, sufraktantów czy rybawiryny (związków o wysokiej aktywności przeciwwirusowej).
Sposoby mikrorozmnażania - kultury pąków bocznych
Kultury te znalazły zastosowanie u:
- roślin ozdobnych (Orchidiaceae, Chrysanthemum, Gloxinia, Spatiphyllum, Nephrolepsis, Gerbera, Dianthus, Funkia, Freesia, Nicotiana)
- drzew owocowych i podkładek drzew owocowych (Corylus avellana, Malus domestica, Pyrus communis, Prunus domestica, Armeniaca vulgaris)
- jagodowych (Fragaria x ananasa)
- tropikalnych i subtropikalnych (Malus paradisiaca, Ananas comosus, Morus sp., Hevea brasiliensis)
Kultury pąków przybyszowych
Kultury pąków przybyszowych
Części rośliny, na których mogą powstawać pąki przybyszowe to:
korzenie
łodygi,
liście,
kwiatostany,
łuski cebulowe
pędy kwiatowe.
Kultury pąków przybyszowych
Metoda wykorzystywana przede wszystkim u roślin, które z trudem wytwarzają pąki boczne.
Na powstawanie i intensywny rozwój pąków przybyszowych w warunkach in vitro wyraźny wpływ mają:
rodzaj i wzajemne proporcje zastosowanych auksyn i cytokin,
warunki fizyczne hodowli (zwłaszcza światło i temperatura),
rodzaj tkanki,
gatunek rośliny,
kondycja kultury.
Kultury pąków przybyszowych
Różnicowanie się pąków przybyszowych następuje:
za pośrednictwem tkanki kalusowej (organogeneza pędowa pośrednia)
bezpośrednio na eksplantacie (kaulogeneza).
Organogeneza pędowa pozwala na uzyskanie wyższego współczynnika rozmnażania w porównaniu do hodowli wierzchołków pędów czy pąków kątowych.
Inna formą organogenezy jest ryzogeneza (tworzenie korzeni przybyszowych).
Jednak bardzo rzadko udaje się odtworzyć roślinę z korzenia, dlatego nie jest ona wykorzystywana w mikrorozmnażaniu.
Kultury pąków przybyszowych
Kultury pąków przybyszowych znalazły zastosowanie u:
- roślin ozdobnych (Orchidaceae, Gesneriaceae, Piperaceae)
- roślin cebulowych (Amaryllidaceae, Iridaceae, Liliaceae)
- zbóż (Oryza sativa, Triticum aestivum, Avena sativa, Hordeum vulgare, Zea mays)
Sposoby mikrorozmnażania - embriogeneza somatyczna
Embriogeneza somatyczna
To proces biologiczny, podczas którego w warunkach in vitro z komórek wegetatywnych formują się zarodki.
Jest on łatwy w automatyzacji, tani i niepracochłonny.
Sposoby mikrorozmnażania - embriogeneza somatyczna
Zarodki somatyczne to proste struktury z wyodrębnioną osią pęd – korzeń, morfologicznie podobne do zarodków zygotycznych wytworzonych w procesie zapłodnienia.
Również ich rozwój jest podobny: pojedyncza komórka, drobne agregaty komórkowe, zarodek kulisty (globularny), sercowaty, torpedowaty i stadium liścieniowe.
W wyniku formowania zarodków somatycznych można w warunkach in vitro uzyskać wysoki współczynnik namnażania materiału roślinnego.
Sposoby mikrorozmnażania - embriogeneza somatyczna
Materiałem wyjściowym do produkcji somatycznych zarodków mogą być:
fragmenty młodych liści,
hipokotyle
liścienie siewek,
igły roślin.
Sposoby mikrorozmnażania - embriogeneza somatyczna
Opisane wcześniej metody rozmnażania polegają na namnażaniu pąków i pędów, czyli struktur jednobiegunowych, a odtwarzanie korzeni zachodzi w kolejnym etapie w laboratorium lub w warunkach in vivo.
Efektem końcowym embriogenezy somatycznej jest kompletna roślina z jednym lub dwoma liścieniami, epikotylem i korzonkiem zarodkowym.
Zarodki somatyczne można z powodzeniem wykorzystać przy produkcji sztucznych nasion.
Sposoby mikrorozmnażania - embriogeneza somatyczna
Metoda znalazła zastosowanie tam, gdzie uzyskanie nasion może być trudne i długotrwałe.
Dzięki niej można otrzymać dowolną ilości zdrowego, wyrównanego materiału siewnego, niezależnie od warunków pogodowych w zaplanowanym terminie.
Sposoby mikrorozmnażania - embriogeneza somatyczna
Istnieją doniesienia, że naukowcy z Kanadyjskiego Centrum Włókien Drzewnych chcą wykorzystać embriogenezę somatyczną do masowej produkcji takiej krzyżówki sosny białej, która będzie odporna na rdzę wejmutkowo-porzeczkową.
Jest to choroba drzew iglastych, przede wszystkim sosen i porzeczek, głównie porzeczki czarnej, wywołana przez patogenny grzyb Cronartium ribicola.
Sposoby mikrorozmnażania - embriogeneza somatyczna
Naukowcy planują również współpracę z partnerami przemysłu leśnego w celu wykorzystania procesu somatycznej embriogenezy do produkcji sadzonek świerka białego o wydajniejszym wzroście i lepszych cechach jakościowych (świerk biały jest coraz chętniej wybieranym gatunkiem drzewa, ponieważ charakteryzuje się podczas całego cyklu hodowlanego wyższą produkcją drewna niż świerk czarny).
Sposoby mikrorozmnażania - embriogeneza somatyczna
Embriogenezę somatyczną wykorzystuje się do:
- komercyjnego rozmnażania drzew leśnych (Pseudotsuga menziesii, Pinus taeda, Picea bies)
- namnażania niektórych gatunków należących do rodzin (Umbelliferae, Solanacae, Cruciferae, Primulaceae)
Przykłady roślin u których wykorzystuje się rozmnażane klonalne
Przykłady roślin u których wykorzystuje się rozmnażane klonalne
Niektóre gatunki roślin sadowniczych rozmnażane in vitro:
Agrest, borówka brusznica, kiwi, ananas jadalny, banan, borówka amerykańska, brzoskwinia, cytryna, czereśnia ptasia, daktylowiec właściwy, grusza pospolita, malina właściwa, jabłoń dzika, mandarynka, kasztan jadalny, marakuja, leszczyna pospolita, migdałowiec zwyczajny, limonka, mirabelka, truskawka, papaja, pomarańcza, porzeczki.
Przykłady roślin u których wykorzystuje się rozmnażane klonalne
Rośliny ozdobne:
Agawa, bluszcz pospolity, cebulica syberyjska, begonia stale kwitnąca, azalia japońska, cyklamen perski, frezja, dracena, goździk ogrodowy, gerbera Jamesona, hoja różowa, lilia biała, grubosz, liliowiec, lak pospolity, róże, sagowce, pelargonie.
Przykłady roślin u których wykorzystuje się rozmnażane klonalne
Drzewa i krzewy:
Akacja, araukaria, brzoza zwisła, dąb czerwony, hortensja ogrodowa, jodła balsamiczna, morwa biała, ostrokrzew, sekwoja olbrzymia, sosna czarna, świerk biały, topola czarna,.
Przykłady roślin u których wykorzystuje się rozmnażane klonalne
Rośliny użytkowe:
Bawełna afrykańska, burak zwyczajny, chmiel zwyczajny, herbata chińska, jęczmień zwyczajny, kawa arabska, koniczyna biała, kauczukowiec brazylijski, kakaowiec właściwy, len zwyczajny, maniok jadalny, oliwka europejska, proso zwyczajne, orzech ziemny, pszenica, słonecznik, ziemniak, żyto, sorgo, pszenica.
Przykłady roślin u których wykorzystuje się rozmnażane klonalne
Warzywa:
Brukselka, cebula, chrzan, cykoria, fenkuł, czosnek, dynia, groszek, kalafior, kapusta, kawon, karczoch, koper, marchew, papryka, pomidor, por, seler, szparag lekarski.
Przykłady roślin u których wykorzystuje się rozmnażane klonalne
Rośliny lecznicze:
Naparstnica purpurowa, bieluń dziędzierzawa, mak lekarski, nagietek lekarski, mniszek lekarski, żeńszeń właściwy.