35. Doskonalenie szczepów przemysłowych stosowanych w biotechnologii
Procesy biotechnologiczne z zastosowaniem mikroorganizmów wyizolowanych bezpośrednio ze środowiska naturalnego na ogół przebiegają z wydajnością niewystarczającą, aby ich użycie na skalę przemysłową było opłacalne ekonomicznie Drobnoustroje pozyskane ze środowiska naturalnego prowadzą procesy biosyntezy lub biotransformacji z wydajnością nie wystarczającą zazwyczaj do opracowania ekonomicznego procesu technologicznego.
Aby wykorzystać potencjał biotechnologiczny tych mikroorganizmów, przeprowadza się modyfikację ich genotypu prowadzącą do uzyskania szczepów produkcyjnych mogących znaleźć zastosowanie w przemyśle
Pomimo kilkudziesięciu lat owocnego stosowania mutagenizacji do ulepszania szczepów przemysłowych nadal opiera się ona na pracochłonnej metodzie prób i błędów, wymagającej stosowania bardzo dużej liczby pojedynczych kultur. Nie można bowiem ustalić jednoznacznej korelacji między miejscem i rodzajem wywołanej mutacji a typem otrzymanego mutanta i ostatecznym efektem fizjologicznym. Można jednak, dzięki doświadczeniu, zoptymalizować procedurę poprzez dobór odpowiednich mutagenów optymalnych dawek, czasu działania, miejsca oddziaływania w cyklu komórkowych, a przede wszystkim poprzez dopracowanie kryteriów efektywnej selekcji pożądanych mutantów
Modyfikację genotypu szczepu macierzystego, wyizolowanego z próbki środowiskowej i scharakteryzowanego taksonomicznie, prowadzi się na drodze:
mutagenezy indukowanej in vivo
Ulepszanie szczepów na drodze rekombinacji genetycznej
fuzji protoplastów komórek szczepów pochodzących od genetycznie różniących się przodków
Mutagenezy indukowane in vivo
Podział mutacji występujących w procesach biotechnologicznych.
Spontaniczne- częstość mniejsza niż 10-5. W przypadku nie korzystnych zmian mogą stanowić poważny problem technologiczny, zwłaszcza w hodowlach ciągłych. Możliwość ich wystąpienia zmusza do ciągłej preselekcji szczepów.
Indukowane-wywołane czynnikami zewnętrznymi - mutagennymi (zwiększając ich częstotliwość od kilku do kilkudziesięciu tysięcy razy). Powstałe mutanty to mutanty indukowane.
Ulepszania szczepów - mutagenizacja
Właściwości mutageniczne posiadają różnorodne związki chemiczne, np:
iperyt azotowy wywołuje mutacje u Drosophila melanogaster
kwas azotowy HNO2 powoduje mutacje w DNA
barwniki akrydynowe
analogi zasad azotowych
nadtlenek wodoru i amoniak
benzopiren - występuje na przykład w dymie papierosowym
kolchicyna - alkaloid roślinny
Mutagenizacja prowadzi do modyfikacja genotypu drobnoustrojów
Czynniki mutagenne dzieli się na fizyczne i chemiczne. Czynniki te zwiększają częstotliwość powstawania mutacji od kilku do kilkudziesięciu tysięcy razy
Czyniki chemiczne i fizyczne wykorzystywane w doskonaleniu mikroorganizmów na drodze mutagenezy
Czynnik mutagenny |
Sposób działania |
Promieniowanie UV |
powstanie dimerów pirymidynowych |
Promieniowanie X |
pęknięcia jedno- i dwuniciowego DNA |
5-bromouracyl |
analog tyminy, tworzy pary z adeniną i guaniną |
2-aminopuryna |
analog adeniny, tworzy pary z tyminą i cytozyną |
Hydroksyloamina |
hydroksylacja cytozyny, pochodna tworzy pary z adeniną |
N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna |
synteza metyloguaniny podczas replikacji, powoduje tranzycje i inne typy mutacji |
Metanosulfonian metylowy Metanosulfonian etylowy |
alkilacja puryn i pirymidyn |
Oranż akrydyny |
interkalacja pomiędzy zasady w DNA, powoduje błędy replikacji i mutacje typu insercja lub delecja |
Kwas azotowy (III) |
deaminacja adeniny, hipoksantyna tworzy pary z cytozyną deaminacja guaniny, ksantyna tworzy pary z cytozyną deaminacja cytozyny, uracyl tworzy pary z adeniną |
Etapy mutagenizacji:
Penetracja mutagenu do komórki
Oddziaływanie na DNA wywołujące niestabilne zmiany pierwotne
Naprawa uszkodzeń pierwotnych z możliwością zajścia trwałych zmian wtórnych w DNA
Stabilizacja mutacji powodująca utrzymanie się zmian w kolejnych pokoleniach
Zmiany biochemiczne w komórce i fenotypowe ujawnienie się mutacji
Etapy selekcji mutantów:
Wstępne testy- eliminacja szczepów mało przydatnych
Dokładniejsza charakteryzacja szczepów wyselekcjonowanych
Dobór optymalnych warunków hodowli i procesów dla najlepszych szczepów uzyskanych w etapach poprzednich.
Ulepszanie szczepów na drodze rekombinacji genetycznej
Hybrydyzacja naturalna - przekazanie informacji genetycznej z komórek dawcy do komórek biorcy w wyniku fizycznego kontaktu obu komórek
polega na wymianie homologicznych fragmentów DNA między chromosomami dawcy i biorcy
w wyniku rozdzielenia materiału genetycznego w komórkach potomnych otrzymuje się hybrydy o zmienionym genotypie
Naturalna hybrydyzacja zachodzi bardzo rzadko !!!
Podstawowe przeszkody utrudniające zajście hybrydyzacji naturalnej
ściana komórkowa
ujemny potencjał po zewnętrznej stronie błony cytoplazmatycznej
Fuzja protoplastów
Hybrydyzacja na drodze fuzji protoplastów (1972 r.)
Rekombinacja zachodzi pomiędzy szczepami o tym samym typie płciowym
Rekombinacja może mieć charakter międzygatunkowy
Możliwość wymiany dużych fragmentów DNA
Każda z hybrydyzujących komórek może pełnić rolę dawcy i biorcy
Możliwość fuzji protoplastów z liposomami zawierającymi obcy materiał genetyczny
Fuzja protoplastów jest najczęściej stosowaną metodą do dalszego ulepszania szczepów pochodzących z różnych linii mutacyjnych za względu na:
zwiększenie wydajności produkcji
ograniczenie wytwarzania produktów ubocznych
zwiększenie szybkości wzrostu
zmiana przyswajalności różnych substratów
zwiększenie oporności na substancje toksyczne
zwiększenie oporności na bakteriofagi