M

IKROBIOLOGIA

T

ECHNICZNA

– studia zaoczne

Ćwiczenie 6

część teoretyczna

___________________________________________________________________________

Ć

WICZENIE

6: D

OSKONALENIE SZCZEPÓW

PRODUKCYJNYCH NA DRODZE MUTAGENIZACJI

Wstęp

Drobnoustroje pozyskane ze środowiska naturalnego prowadzą procesy biosyntezy lub

biotransformacji z wydajnością nie wystarczającą zazwyczaj do opracowania ekonomicznego
procesu technologicznego. Dzięki funkcjonowaniu mechanizmów regulacyjnych,
ukształtowanych na drodze ewolucji, charakteryzują się one skoordynowanym
i zbilansowanym metabolizmem. Dobierając warunki hodowli można częściowo zmieniać
aktywność metaboliczną szczepów dzikich i uzyskiwać podwyższenie wydajności
pożądanego produktu, ale zawsze w granicach określonych genotypem. Zasadnicze zmiany
metaboliczno-fizjologiczne można uzyskać w wyniku modyfikacji genotypu drobnoustrojów,
a jednym z podstawowych sposobów są mutageneza (i selekcja mutantów o cechach
korzystnych dla danego procesu) oraz fuzja protoplastów. Należy pamiętać, że selekcja
mutantów zawsze ma charakter fenotypowy, gdyż prowadzona jest w warunkach określonego
środowiska, co nie gwarantuje, że wyselekcjonowany szczep reprezentuje najlepszy genotyp.

Pomimo kilkudziesięciu lat owocnego stosowania mutagenizacji do ulepszania

szczepów przemysłowych nadal opiera się ona na pracochłonnej metodzie prób i błędów,
wymagającej stosowania bardzo dużej liczby pojedynczych kultur. Nie można bowiem ustalić
jednoznacznej korelacji między miejscem i rodzajem wywołanej mutacji a typem
otrzymanego mutanta i ostatecznym efektem fizjologicznym. Można jednak, dzięki
doświadczeniu, zoptymalizować procedurę poprzez dobór odpowiednich mutagenów,
optymalnych dawek, czasu działania, miejsca oddziaływania w cyklu komórkowych, a przede
wszystkim poprzez dopracowanie kryteriów efektywnej selekcji pożądanych mutantów.

1. M

UTACJE SPONTANICZNE

W genomie nieustannie zdarzają się przypadkowe mutacje, chociaż istnieją tzw. gorące

miejsca, w których częstość tych mutacji jest znacznie wyższa. Częstość mutacji
spontanicznych może się wahać od 1 mutacji na gen na każde 10

4

rund replikacyjnych do

jednej na każde 10

11

rund (przeciętnie 10

-6

, czyli jedna mutacja na każde 10

6

rund).

Spontaniczne mutacje są wynikiem m.in. błędów polimerazy podczas replikacji,

fizycznego uszkodzenia DNA, rekombinacji i transpozycji. Istnieją jednak liczne systemy
naprawcze, które wychwytują i naprawiają uszkodzenia i błędy, minimalizując częstość
mutacji.

Podstawowym powodem zmian w strukturze DNA jest zdolność do tworzenia przez

zasady form tautomerycznych. Podczas replikacji adenina, która normalnie tworzy parę z
tyminą, może ulec tautomeryzacji do swej formy iminowej i utworzyć parę z cytozyną. Jeśli
ten błąd nie zostanie zauważony przed następną replikacją to para A-T zostanie zastąpiona
parą G-C.

__________________________________________________________________________________________

K

ATEDRA

T

ECHNOLOGII

F

ERMENTACJI I

M

IKROBIOLOGII

T

ECHNICZNEJ

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

1

M

IKROBIOLOGIA

T

ECHNICZNA

– studia zaoczne

Ćwiczenie 6

część teoretyczna

___________________________________________________________________________

Mutacje spontaniczne powstają także w wyniku tzw. poślizgu polimerazy, podczas

syntezy nici DNA w miejscach występowania krótkich powtórzonych sekwencji, co prowadzi
do insercji lub delecji krótkiego fragmentu DNA a w rezultacie do zmiany jego struktury.
Dość często zachodzi także oksydatywna deaminacja cytozyny do uracylu, który nie jest
poprawnie rozpoznawany i po usunięciu pozostaje puste miejsce. Również wbudowanie
elementu transpozycyjnego w strukturę genu powodu mutację.

2. C

ZYNNIKI MUTAGENNE

Częstość mutacji można zwiększyć nawet kilka tysięcy razy działając na komórki

czynnikami mutagennymi (mutagenami). Powstałe w ten sposób mutacje nazywamy
mutacjami indukowanymi. Wyróżniamy 3 typy mutacji: punktowe (dotyczą pojedynczych
zasad, mogą nie zmieniać struktury białka, zmieniać pojedynczy aminokwas lub skracać
łańcuch polipeptydowy do miejsca mutacji), delecje oraz insercje (czyli wstawienie lub
usunięcie jednej lub większej liczby zasad w DNA, prowadzące do przesunięcia ramki
odczytu, powodują że od miejsca mutacji całe białko ma zmienioną strukturę).

Istnieje wiele czynników fizycznych i chemicznych, które wykazują działanie mutagenne.

W odpowiednio dużych dawkach będą działały bójczo, ale w mniejszych mutagennie.

2.1. A

NALOGI ZASAD

Są antymetabolitami. Przypominają normalne puryny i pirymidyny i po włączeniu do DNA
funkcjonują prawie jak normalne zasady, mają jednak większą skłonność do tworzenia par z
błędnie dobranym partnerem. Należą tu: 5-bromouracyl i 5-bromodeoksyurydyna
(zastępujące tyminę, tworzą parę z guaniną), 2-aminopuryna (zastępuje adeninę, para z
cytozyną).

2.2.

CZYNNIKI INTERKALUJĄCE

Są to płaskie, trójpierścieniowe związki podobne w kształcie do par zasad. Mogą one wnikać
do DNA, prowadząc do zniekształcenia helisy, zwiększenia odległości między zasadami co
powoduje pomyłki podczas replikacji (insercje i delecje). Należą tu barwniki akrydynowe:
oranż akrydyny i bromek etydyny.

2.3

CZYNNIKI MODYFIKUJĄCE

DNA

Są to związki chemiczne, które oddziałują na zasady w istniejącym DNA, prowadząc do
błędnego sparowania. Na przykład azotany (III) powodują deaminację adeniny (tworzy
hipoksantynę), guaniny i cytozyny, w efekcie powstają mutacje punktowe. Hydroksylamina
reaguje z cytozyną powodując, że zaczyna tworzyć parę z adeniną. MNNG (N-metylo-N’-
nitro-N-nitrozoguanidyna) powoduje metylację zasad.

2.4. K

WAS AZOTOWY

Bardzo silny mutagen, reaguje z zasadami w RNA i DNA powodując ich deaminację
(mutacje punktowe) i przekrzyżowanie nici, szczególni aktywny wobec RNA wirusów i
bakteriofagów o jednoniciowym DNA.

2.5.

PROMIENIOWANIE JONIZUJĄCE

Promieniowanie o długości fal 254-265 nm (tzw. daleki ultrafiolet) jest silnie pochłaniane
przez kwasy nukleinowe, w dużych dawkach jest letalne, w mniejszych powoduje

__________________________________________________________________________________________

K

ATEDRA

T

ECHNOLOGII

F

ERMENTACJI I

M

IKROBIOLOGII

T

ECHNICZNEJ

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

2

M

IKROBIOLOGIA

T

ECHNICZNA

– studia zaoczne

Ćwiczenie 6

część teoretyczna

___________________________________________________________________________

uszkodzenia w DNA. Są to w 90% dimery pirymidyn, głównie tyminy. Mutacja powstaje na
skutek zniekształcenia helisy, co uniemożliwia replikację i transkrypcję DNA, ale także gdy
komórka próbuje naprawić uszkodzenie używając niedoskonałego systemu naprawczego
zwanego SOS (powoduje liczne błędy).
Mutacje prowadzi się także w bliskim UV (ok. 360 nm) w połączeniu z 8-
metoksypsoralenem, czynnikiem uczulającym DNA na ten rodzaj promieniowania.
Promieniowanie jonizujące o wysokiej energii powoduje wybicie elektronów i jonizację
cząsteczek, powstające reaktywne wolne rodniki reagują z zasadami azotowymi i powodują
rozerwanie jednej (uszkodzenie może być naprawione) lub obu nici DNA (letalne).

2.6.

MUTAGENEZA IN VITRO

Ostatnio coraz częściej stosowana metoda, polegająca na syntezie chemicznej sekwencji
DNA, która następnie jest wykorzystana do zastąpienia fragmentu DNA w genomie szczepu
dzikiego.

Ważną kwestię stanowi dobór odpowiedniej dawki mutagenu. Początkowo uważano,

że optymalna jest dawka o efekcie letalnym wynoszącym ponad 99%. Obecnie stosuje się
mniejsze dawki, uzyskując dobre wyniki przy przeżywalności powyżej 10%. Znane są
również przykłady otrzymywania wartościowych mutantów przy zachowaniu blisko 100%
przeżywalności. Zbyt duże dawki mutagenu powodują powstanie wielu uszkodzeń
równocześnie, dając najczęściej niekorzystne efekty, co może maskować ewentualne
pożądane mutacje. Celowe jest zatem stworzenie takich warunków mutagenizacji, aby
wyselekcjonowane szczepy charakteryzowały się pojedynczymi mutacjami.

3. M

ETABOLICZNE WARUNKI MUTAGENEZY

Formą materiału biologicznego najbardziej dogodną do przeprowadzania mutagenizacji są

pojedyncze, jednojądrowe komórki haploidalne. U promieniowców i grzybów
najkorzystniejsze jest użycie w tym celu spor. Jeśli szczepy nie wytwarzają spor, wówczas
mutagenizacji poddawane są niewielkie fragmenty mechanicznie rozdrobnionej grzybni
wegetatywnej.
Efektywność procesu mutagenizacji zależy nie tylko od rodzaju użytego czynnika, ale
również od tego z jakiej fazy hodowli pochodzą komórki. Mutageny reagujące z DNA (np.
kwas azotawy, odczynniki alkilujące, promieniowanie UV) mogą być stosowane zarówno
wobec komórek spoczynkowych, jak i aktywnie namnażających się. Inne (np. MNNG, 5-
bromouracyl, 2-aminopuryna) najaktywniej działają w fazie replikacji.
Również skład pożywki i warunki hodowli przed zadziałaniem mutagenu wpływają na
jego skuteczność. Bakterie hodowane w podłożu minimalnym są bardziej odporne na
działanie mutagenów niż komórki hodowane w podłożu bogatym w zasady purynowe i
pirymidynowe. Działanie mutagenne promieniowania jonizującego stymuluje obecność
tlenu, ale w przypadku hydroksylaminy zwiększa jedynie efekt letalny.

Pierwotne zmiany w strukturze DNA są eliminowane dzięki istnieniu w komórce
mechanizmów naprawczych, do których zalicza się m.in. fotoreaktywację (światło
widzialne aktywuje enzym rozszczepiający dimery tyminowe). Odpowiednia duża dawka
mutagenu powoduje, że organizm nie jest w stanie naprawić wszystkich uszkodzeń, co może
spowodować także śmierć komórki. Mechanizmy naprawcze mogą przywrócić genotyp do

__________________________________________________________________________________________

K

ATEDRA

T

ECHNOLOGII

F

ERMENTACJI I

M

IKROBIOLOGII

T

ECHNICZNEJ

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

3

M

IKROBIOLOGIA

T

ECHNICZNA

– studia zaoczne

Ćwiczenie 6

część teoretyczna

___________________________________________________________________________

stanu wyjściowego (niemutagenne, np. fotoreaktywacja, wycinanie uszkodzonych
fragmentów i resynteza DNA, rekombinacja) lub spowodować trwałe, wtórne błędy w
strukturze DNA. Do tych drugich należy przede wszystkim tzw. mechanizm SOS indukowany
po zatrzymaniu replikacji DNA, który funkcjonuje po zadziałaniu promieniami UV,
jonizującym oraz większością mutagenów chemicznych. Odmienne systemy naprawcze
działają po MNNG. Uszkodzenia poreperacyjne są głównym źródłem powstawania
mutantów.

Wzrost częstotliwości mutacji można też uzyskać inkubując komórki w obecności

inhibitorów niemutagennych mechanizmów naprawczych: akryflawina, kofeina,
metylopuryny, chinony, kwaśny siarczyn sodowy, arsenin sodowy.

Często zdarza się, że pomimo zaistnienia korzystnej mutacji może ona pozostać nie

wykryta. Do przyczyn takiego stanu zalicza się:

- zbyt szybkie testowanie materiału pomutacyjnego (przed zakończeniem procesu

stabilizacyjnego mutacji)

- testowanie w warunkach uniemożliwiających indukcję (derepresję)
- testowanie populacji komórek (kolonii) genetycznie niejednorodnych
- testowanie przed rozdzieleniem jąder (genoforów) w przypadku komórek

wielojądrowych i organizmów wielokomórkowych.

4. S

ELEKCJA MUTANTÓW

Selekcję szczepów, zarówno wariantów naturalnych, jak i mutantów przydatnych do

celów technologicznych, można prowadzić w dwojaki sposób:

jednoetapowo – stosując testy skriningowe już podczas izolacji kolonii

dwuetapowo – testując wcześniej wyizolowane czyste kultury.

Testowanie wszystkich kultur jest czasochłonne i mało wydajne, dlatego dąży się do

opracowania szybkich testów wstępnej oceny, umożliwiających ukierunkowaną selekcję
kultur wyrastających na odpowiednim podłożu agarowym, charakteryzujących się
korzystnymi cechami przemysłowymi. Najczęściej testy te opierają się na wykorzystaniu
zjawiska dyfuzji pozakomórkowych produktów metabolizmu w podłożu agarowym
i określeniu wielkości powstających stref ich przenikania (przy użyciu określonych
wskaźników, specyficznych wywoływaczy lub organizmów testowych).

4.1. M

ETODA PŁYTKOWA Z UŻYCIEM WSKAŹNIKÓW

Istnieje szereg testów umożliwiających przy użyciu indykatorów szybkie, półilościowe
różnicowanie kolonii drobnoustrojów, wytwarzających lub przekształcających wiele
związków chemicznych. Wytwarzanie kwasów organicznych i amin można wykazać stosując
np. błękit bromofenolowy lub czerwień obojętną, które zmieniają barwę w zależności od pH.
Szczepy syntezujące enzymy amylolityczne można różnicować na podłożu ze skrobią (po
zalaniu jodem widać przejaśnienia), enzymy proteolityczne z kazeiną, celulolityczne
obserwując strefy rozpuszczania celulozy barwionej czerwienią Kongo, a aktywność
pektynolityczną na podstawie upłynniania żelu pektynowego. Wykrycie syntezy nukleaz
możliwe jest dzięki testom z kwasem solnym, powodującym zmętnienie w miejscach
zawierających niezhydrolizowany kwas nukleinowy oraz z oranżem akrydyny i obserwacją w
nadfiolecie fluorescencji w miejscach z nierozłożonym DNA

__________________________________________________________________________________________

K

ATEDRA

T

ECHNOLOGII

F

ERMENTACJI I

M

IKROBIOLOGII

T

ECHNICZNEJ

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

4

M

IKROBIOLOGIA

T

ECHNICZNA

– studia zaoczne

Ćwiczenie 6

część teoretyczna

___________________________________________________________________________

4.2. M

ETODA PODWÓJNEJ HODOWLI NA PŁYTKACH

P

ETRIEGO

Do selekcji szczepów produkujących antybiotyki, witaminy czy aminokwasy stosuje się
metodę, w której testowane kolonie, wyrosłe na jednym podłożu (A) zalewa się warstwą
innego (B), zaszczepionego odpowiednio dobranych organizmem testowym (rys. 1A.).

Rys. 1. Metody selekcji
szczepów produkujących
substancje czynne
biologicznie; A – zastosowanie
folii półprzepuszczalnej, B –
użycie podwójnych płytek z
przegrodą półprzepuszczalną,
C – metoda bloczków
agarowych, D – metoda
bloczków agarowych
połączona z użyciem wskaźnika
barwnego.

Wokół kolonii wytwarzających antybiotyki powstają strefy zahamowania wzrostu

szczepu testowego, których wielkość zależy od ilości antybiotyku wydzielanego poza
komórkę i jego dyfuzji w żelu agarowym oraz od wrażliwości szczepu testowego.
Szczepami testowymi w pracach nad drobnoustrojami produkującymi aminokwasy lub
witaminy są mutanty auksotroficzne (pokarmowe), które wymagają do swojego wzrostu
określonego czynnika. Strefy wzrostu wokół badanych kolonii świadczą o wytwarzaniu
i wydzielaniu przez nie badanego metabolitu.
Metody te nie są jednak przydatne w przypadku produktów gromadzonych
wewnątrzkomórkowo. Przysparzają one też kłopotów z izolacją czystych kultur szczepu
produkcyjnego, bez domieszek szczepu testowego.

W związku z tym opracowano modyfikacje tej metody. Najprostszą z nich jest

oddzielenie podłoża z organizmem testowym od kolonii badanych cienką folią celofanową.
Innym rozwiązaniem jest zastosowanie dwustronnych płytek z tworzywa syntetycznego,
przegrodzonych półprzepuszczalną membraną o średnicy porów 0,2

µ

m. Z jednej strony, na

podłożu A rosną testowane kolonie, z drugiej zaś na podłożu B, szczep testowy (rys. 1B.).
Membrana stanowi skuteczną przegrodę dla komórek drobnoustrojów, umożliwia natomiast
swobodną dyfuzję cząsteczek wytwarzanego metabolitu.
Metody te wykorzystywane są podczas selekcji kultur izolowanych ze środowiska
naturalnego lub mutantów w początkowym etapie ich ulepszania (o niskiej jeszcze
wydajności).

__________________________________________________________________________________________

K

ATEDRA

T

ECHNOLOGII

F

ERMENTACJI I

M

IKROBIOLOGII

T

ECHNICZNEJ

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

5

M

IKROBIOLOGIA

T

ECHNICZNA

– studia zaoczne

Ćwiczenie 6

część teoretyczna

___________________________________________________________________________

4.3. M

ETODA KRĄŻKÓW AGAROWYCH

Z hodowli płytkowej wycina się sterylnie krążki podłoża z testowanymi koloniami, inkubuje
się je w warunkach dobrego nawilżenia powietrza, a następnie przenosi na płytki z podłożem
zawierającym drobnoustrój testowy (rys. 1C.).

4.4. M

ETODA REPLIK

Technika ta polega na przeniesieniu odcisku kolonii z płytki wyjściowej na płytki z jałowym
podłożem przy pomocy welwetowego stempla. Kolonie wyrosłe na replikach służą do
testowania syntezy metabolitów, podczas gdy płytka wyjściowa pozostaje nie zakażona do
izolacji wybranych kolonii (rys. 2.). Możliwość wykonania większej liczby replik pozwala na
badanie aktywności względem dużej liczby szczepów testowych.

Rys. 2. Selekcja mutantów auksotroficznych metodą replik; 1-3 – podłoża kompleksowe, 2 – pożywka minimalna

4.5. N

OWE METODY SKRININGU LEKÓW PRZECIW CHOROBOM INFEKCYJNYM

Po niepowodzeniach, jakimi zakończyły się metody stosowania klasycznych antybiotyków do
leczenia infekcji wirusowych, obecne wysiłki zmierzają w kierunku skriningu
antymetabolitów oraz inhibitorów enzymów, gł. wirusowych (neuramidazy i hialuronidazy)
oraz inhibitorów syntezy białek, DNA i RNA. leków przeciwbakteryjnych poszukuje się
wśród inhibitorów syntezy ściany komórkowej bakterii, a środków przeciwgrzybiczych
i owadobójczych – wśród inhibitorów syntezy chityny. Do skriningu antybiotyków używa się
superwrażliwych oraz szczególnie opornych szczepów testowych, nie stosowanych do tej
pory. Ten drugi rodzaj jest źródłem enzymów, które inaktywują lub degradują antybiotyki.
Ich inhibitory mają istotne znaczenie medyczne. Dotychczas wykryto m.in. kwas
klawulanowy i inne inhibitory

β-laktamaz, enzymów odpowiedzialnych za destrukcję

pierścienia

β-laktamowego w penicylinach i cefalosporynach. Identyfikacja tych inhibitorów

polega na zalewaniu krążków agarowych z wyrosłymi badanymi drobnoustrojami, agarem

__________________________________________________________________________________________

K

ATEDRA

T

ECHNOLOGII

F

ERMENTACJI I

M

IKROBIOLOGII

T

ECHNICZNEJ

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

6

M

IKROBIOLOGIA

T

ECHNICZNA

– studia zaoczne

Ćwiczenie 6

część teoretyczna

___________________________________________________________________________

zawierającym

β-laktamazę. Po okresie niezbędnym do dyfuzji inhibitora i wystąpienia reakcji

między enzymem i inhibitorem, całość pokrywa się drugą warstwą agaru, zawierającą substrat
dla tego enzymu i jednocześnie chromogen. Może to być np. nitrocefina – półsyntetyczna
cefalosporyna o barwie żółtej. Wokół kolonii wytwarzających inhibitory

β-laktamaz

pozostaje strefa niezmienionej barwy żółtej, podczas gdy reszta płytki, w wyniku
enzymatycznej degradacji nitrocefiny, zmienia kolor na czerwony (rys. 1D.).

4.6.

SKRINING INNYCH METABOLITÓW AKTYWNYCH FARMAKOLOGICZNIE

Najważniejszą grupę tych substancji stanowią leki przeciwnowotworowe. Poszukuje się ich
wśród inhibitorów syntezy DNA, RNA i białek. Należą tu antymetabolity, zwłaszcza analogi
strukturalne zasad purynowych, pirymidynowych i ich nukleozydów. Skrining jest
stosunkowo prosty, gdyż antymetabolity przejawiają silną aktywność przeciwbakteryjną w
podłożach ubogich (minimalnych), zanikającą po uzupełnieniu ich odpowiednimi
metabolitami lub w podłożach kompleksowych.

4.7. S

ELEKCJA MUTANTÓW AUKSOTROFICZNYCH

Mutanty auksotroficzne (pokarmowe) mogą rosnąć w pożywce minimalnej uzupełnionej
wymaganym czynnikiem wzrostowym, np. aminokwasem, witaminą, zasadą azotową.
Prowadząc selekcję auksotroficznych mutantów bakterii wrażliwych na antybiotyki
zakłócające syntezę ściany komórkowej, stosuje się metodę penicylinową (rys. 3.).

zawiesina

pomutacyjna

hodowla w podłożu

wzbogaconym

wirowanie i umieszczenie w

wodzie destylowanej

hodowla w podłożu

minimalnym

dodatek

penicyliny

wzrost prototroficznych
sferoplastów

pękanie sferoplastów

wzrost auksotrofów

Rys. 3. Metoda penicylinowa wzbogacania populacji w komórki auksotroficzne

Zawiesina pomutacyjna bakterii wprowadzana jest do podłoża minimalnego, stabilizowanego
solami mineralnymi, cukrami lub alkoholami wielowodorotlenowymi, w którym rosną
jedynie komórki prototroficzne. Dodatek penicyliny lub innych antybiotyków powoduje
namnażanie się komórek pozbawionych fragmentów ściany komórkowej (tzw. sferoplastów).
Po oddzieleniu ich od podłoża i umieszczeniu w wodzie destylowanej, prototroficzne
sferoplasty pękają, podczas gdy komórki auksotroficzne, które nie mając możliwości rozwoju
w podłożu przeżyły kolejne etapy postępowania, odwirowuje się i umieszcza w podłożu

__________________________________________________________________________________________

K

ATEDRA

T

ECHNOLOGII

F

ERMENTACJI I

M

IKROBIOLOGII

T

ECHNICZNEJ

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

7

M

IKROBIOLOGIA

T

ECHNICZNA

– studia zaoczne

Ćwiczenie 6

część teoretyczna

___________________________________________________________________________

uzupełnionym odpowiednimi składnikami. W tych warunkach następuje namnażanie
auksotrofów.
Dalszą selekcję auksotrofów prowadzi metodą replik (rys. 2.), w której przy pomocy stempla
welwetowego odciśnięte kolonie wyrosłe na podłożu kompleksowym (płytka 1) przenoszone
są na podłoże minimalne (płytka 2), a następnie na kontrolną płytkę 3 z podłożem
kompleksowym. Na płytce 2 rosną jedynie prototrofy, stąd porównując wzrost na płytkach
można ustalić położenie kolonii auksotrofów na płytce 1.

4.8. S

ELEKCJA SZCZEPÓW OPORNYCH NA SUBSTANCJE TOKSYCZNE

Kolonie o zwiększonej oporności na toksyczne analogi metabolitów lub toksyczne prekursory
produktów końcowych oraz na antybiotyki i inne tego typu substancje można
wyselekcjonować metodą płytek gradientowych (rys. 4.) lub stosując zestaw płytek z różnymi
stężeniami związków toksycznych. Dzięki temu izoluje się kolonie wyrosłe w strefie dużego
stężenia badanego związku. Największe znaczenie metoda ta znalazła w selekcji mutantów
regulatorowych o zniesionych lub zmienionych mechanizmach represji i hamowania. Z takich
mutantów można wyodrębnić wartościowe szczepy przemysłowe nadprodukujące
aminokwasy albo aktywnie degradujące ksenobiotyki.

Rys. 4. Metoda płytek
gradientowych selekcji mutantów
opornych na toksyczną substancję;
ST – stężenie substancji
toksycznej, A – płytka z podłożem
zaweirającym ST, B – płytka
zalana drugą warstwą podłoża
(bez ST), C – w wyniku dyfuzji
powstaje gradient stężenia
substancji toksycznej, D –
rozmieszcenie kolonii na płytce
gradientowej.

Literatura:

1. Chmiel A.: Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne. PWN,

Warszawa, 1991.

2. Nicklin J., Graeme-Cook K., Paget T., Killington R.: Krótkie wykłady -

Mikrobiologia. PWN, Warszawa 2000.

3. Libudzisz Z., Kowal K.: Mikrobiologia techniczna (tom I), PŁ, Łódź, 2000

__________________________________________________________________________________________

K

ATEDRA

T

ECHNOLOGII

F

ERMENTACJI I

M

IKROBIOLOGII

T

ECHNICZNEJ

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

8