Inne zastosowania metod nowoczesnej biotechnologii

Szczepionki tradycyjne

• Jako szczepionki wykorzystywano

tradycyjnie

• --Preparaty zawierające żywy

organizm patogenny osłabiony dzięki

wielokrotnym pasażom w hodowlach

• --Preparaty zawierające martwy

organizm patogenny

• --Preparaty zawierające

immunogenne epitopy organizmu

patogennego

NIEBEZPIECZEŃSTWO!

• --mogło dojść do ponownego

uaktywnienia organizmu
patogennego

• --zabicie wszystkich

chorobotwórczych organizmów
mogło się nie udać

Definicje/patogen

Patogen, czynnik chorobotwórczy

– ciało obce,

twór biologiczny czy mikroorganizm wywołujący

chorobę u danego organizmu. Wyróżnia się

następujące typy patogenów:

• ożywione (

bakterie, wirusy, "robaki

pasożytnicze

• psychiczne

• nieożywione:

– chemiczne (

substancje żrące, toksyczne

– fizyczne (

światło lasera, promieniowanie jonizujące,

silne pole magnetyczne, mechaniczne

– Zazwyczaj pojęcie to odnosi się do

czynników

biologicznych

Definicje/przeciwciała

• Przeciwciała lub

immunoglobuliny – białka
wydzielane przez komórki
plazmatyczne (czyli pobudzone
limfocyty B) w przebiegu odpowiedzi
immunologicznej typu humoralnego,
które mają zdolność do swoistego
rozpoznawania

antygenów

Przeciwciała

• Przeciwciała (immunoglobuliny) mają

kształt litery Y i składaja się z czterech

łańcuchów polipeptydowych połączonych

wiązaniami disiarczkowymi.

• Dwa identyczne

łańcuchy lekkie (L)

zbudowane są z około 220 aminokwasów

• Dwa identyczne

łańcuchy ciężkie (H)

zbudowane są z około 440

aminokwasów.

• Przeciwciało zawiera dwa miejsca

wiązania z antygenem (oznacza to, że

przeciwciało jest dwuwartościowe)

Definicje/ antygen

• Antygenem (gr. ἀντί anti - przeciw,

γένος genos - ród, rodzaj; przytaczane
także ang. antigen =

antibody

generator

, generator przeciwciał) może

być każda substancja, która wykazuje
dwie cechy:

immunogenność

, czyli

zdolność wzbudzenia przeciwko sobie
odpowiedzi odpornościowej swoistej,
oraz

antygenowość

, czyli zdolność do

reagowania z

przeciwciałami

Definicje/epitop

• Epitopem

lub

determinantą antygenową

nazywamy fragment

antygenu

, który łączy

się bezpośrednio z

przeciwciałem

• Dany epitop może silniej lub słabiej

pobudzać

układ odpornościowy

. Te

epitopy danego antygenu, które wywołują
najsilniejszą

odpowiedź odpornościową

danego gatunku lub osobnika noszą nazwę

determinant immunodominujących

Szczepionki wytwarzane

metodami inżynierii

genetycznej

• Do wytwarzania szczepionek używa

się

• ---organizmów patogennych

nieodwracalnie

osłabionych

przez

delecję określonych genów

• ---wektorów pochodzenia wirusowego

zrekombinowanych z genami

kodującymi immunogenne białka

organizmu patogennego

• ---preparatów immunogennych

peptydów i białek uzyskanych

metodami inżynierii genetycznej

Tego typu szczepionki są

znacznie bardziej

bezpieczne!!

• Głównym problemem w

konstruowaniu szczepionek
zawierających antygeny
powierzchniowe (zazwyczaj
glikoproteiny płaszcza wirusa lub
błony komórkowej bakterii) jest
właściwa prezentacja antygenu
w formie przypominającej jego
natywną konformację

Szczepionki przeciwko

wirusowemu zapaleniu wątroby

typu B

Czynnik etiologiczny – wirus

HBV

 Rodzina: Hepadnaviridae

 Rodzaj: Orthohepadnavirus
 Struktura:

ikosaedralny

nukleokapsyd

otoczony

podwójną osłonką; kulisty; śr. 42
nm

 Kwas nukleinowy: DNA
 Replikacja: hepatocyty
 Rezerwuar: człowiek

Szczepionki przeciwko

wirusowemu zapaleniu wątroby

typu B

 Droga przenoszenia: krew i

płyny

ustrojowe,

tym

wydzielina

szyjki

macicy,

nasienie



Wysoka zakaźność – nawet 0,1

μl

krwi

może

spowodować

zakażenie

 Hodowla

warunkach

laboratoryjnych – nie zakaża

zarodków kurzych i powszechnie

stosowanych linii komórkowych

We krwi do 10

wirusów/ml

Szczepionki przeciwko

wirusowemu zapaleniu wątroby

typu B

Antygeny wirusa HBV

 HBcAg – białko rdzenia
 HBeAg – białko rdzenia


HBsAg – białko powierzchniowe

• tworzy zewnętrzną osłonkę wirusa
• nadmiar białka obecny we krwi w

postaci

kulistych

lub

pałeczkowatych agregatów

Szczepionki przeciwko wirusowemu

zapaleniu wątroby typu B

Odpowiedź immunologiczna

na zakażenie HBV

 Odpowiedź humoralna

• przeciwciała anty-HBsAg (preS1,

preS2 i S)

• przeciwciała anty-HBcAg
• przeciwciała anty-HBeAg

 Odpowiedź komórkowa

• limfocyty Tc

Szczepionka przeciw HBV

• Wirus HBV ma niewielki genom (3182

nukleotydy) a jego kapsyd

zbudowany jest z glikoproteiny

HBsAg.

• Hepatocyty (komórki wątroby)

chorego wydzielają do krwi sferyczne,

nieinfekcyjne twory o średnicy 22 nm

zbudowane z HBsAg i lipidów oraz

zakaźne cząstki o średnicy 42 nm,

zawierające DNA wirusa.

Szczepionka przeciw HBV

• Do początku lat 80-tych jedyną

szczepionka przeciw HBV był preparat
inaktywowanych formaliną cząstek 22
nm.

• Ilość tej szczepionki była uzależniona

od dostępności zainfekowanej surowicy
i koniecznością przestrzegania bardzo
rygorystycznych procedur
wykluczających obecność innych
elementów infekcyjnych.

Szczepionki przeciwko

wirusowemu zapaleniu wątroby

typu B

Szczepionki II generacji

(rekombinowane)

Pierwsza szczepionka

zarejestrowana w 1986 r.

 Substancja czynna – białkowy

antygen powierzchniowy HBsAg

• białko S

 Sposób

otrzymywania

–

produkcja

białka

komórkach

drożdży

cerevisiae

Szczepionki przeciwko wirusowemu

zapaleniu wątroby typu B

Szczepionki II

generacji

(rekombinowane)

Pierwszy układ

ekspresyjny opublikowany

w 1982 r.

(P. Valenzuela,

A. Medina, W.J. Rutter, Nature,

289, 347 – 350)

 wektor ekspresyjny – pHBS-

• autonomiczna replikacja

• ori replikacji pBR322
• gen oporności na ampicylinę
• ori replikacji plamidu 2μ
• gen trp1
• sekwencja kodująca białko S

pod kontrolą promotora ADH I

dehydrogenazy alkoholowej I

Szczepionki przeciwko

wirusowemu zapaleniu wątroby

typu B

Szczepionki II generacji

(rekombinowane)

 Adiuwant – wodorotlenek glinu
 Postać szczepionki – płynna
 Temperatura przechowywania – 2-8°C
 Sposób podawania – domięśniowo
 Dawkowanie – 3 dawki (1 - dzień 0; 2 – po 6

tyg.; 3 – po 6 m-cach od pierwszego

szczepienia)

 Skuteczność szczepionki

Szczepionka przeciw HBV

• Konstruując szczepionkę

metodami inżynierii genetycznej,
wprowadzono do plazmidu
sekwencję kodującą HBsAg (835
zasad). Uzyskano dobry poziom
ekspresji i produkt wykazywał
właściwości immunologiczne
podobne do cząstek 22 nm.

Szczepionka przeciw HBV

• Właściwości immunogenne

ulepszono poprzez wprowadzenie

przed genem HBsAg tzw.

sekwencji pre-S (sekwencja

kodująca 55 aminokwasy

współdziałające w rozpoznawaniu

hepatocytów przez wirusa).

• Szczepionka ta wykazała dużą

skuteczność w testach grup

wysokiego ryzyka

Szczepionka przeciwko ospie

prawdziwej

pierwsza szczepionka wynaleziona przez

człowieka

W 1796 roku Edward Jenner,

praktykujący na wsi angielski lekarz,

odkrył pierwszą na świecie

szczepionkę.

Zaobserwował,

że

kobiety

Zaobserwował,

że

kobiety

zatrudnione przy dojeniu krów, które

miały na rękach blizny spowodowane

ospą krowią, nie chorowały na ospę

prawdziwą, nawet przebywając wśród

chorych na ospę prawdziwą członków

rodziny.

Szczepionka przeciwko ospie

prawdziwej

pierwsza szczepionka wynaleziona przez

człowieka



14 maja 1796 r. Edward
Jenner

zaszczepił

ośmioletniego chłopca Jamesa
Phippsa wirusem ospy krowiej
pochodzącym z krost na
rękach dojarki Sarah Nelmes



7 tygodni później Jenner
inokulował Phippsa wirusem
ospy prawdziwej

chłopiec nie zachorował

W ten sposób narodziło się szczepienie nazwane przez E.

Jennera vaccination (od łac.

vacca

– krowa).

Wirus krowianki

• Zalety wirusa krowianki
• --- brak cech chorobotwórczych

dla człowieka

• --- łatwe namnażanie się w

hodowlach komórkowych in vitro

• ---jest to wirus najdłużej

stosowany jako szczepionka

uodparniająca ludzi przed ospą

ludzką

Wirus krowianki

• E. Jenner użył przeszło 200 lat temu

wirusa krowianki jako szczepionki
przeciw czarnej ospie (szczepień
zaniechano w 1980 roku)

• Wirusa krowianki używa się szeroko do

wytwarzania żywych, poliwalentnych
szczepionek dla ludzi i zwierząt.

• Wirus krowianki posłużył do

opracowania innej strategii produkcji
szczepionki przeciw HBV.

Szczepionka przeciw HBV

skonstruowana w oparciu

wykorzystanie wirusa krowianki

• Sklonowany w plazmidzie bakteryjnym

gen HBsAg otoczony sekwencjami wirusa

krowianki i wprowadzony do komórek

zainfekowanych wirusem krowianki ulega

homologicznej rekombinacji z DNA wirusa.

• Rekombinacją steruje się w taki sposób

aby zachodziła w regionach sekwencji

nieistotnych dla cyklu życia wirusa.

Długość takich sekwencji sprawia, ze

wirus krowianki może być jednocześnie

zrekombinowany z wieloma genami

(możliwość produkcji szczepionek

poliwalentnych

Szczepionka przeciw HBV

skonstruowana w oparciu

wykorzystanie wirusa krowianki

• Szczepionka otrzymana w

oparciu o wirusa krowianki
okazała się skuteczna,
prowadząc do wytworzenia
odpowiednich specyficznych
przeciwciał.

Zalety szczepionek

rekombinowanych

• Szczepionki otrzymywane metodami

rekombinacji DNA są stabilne a
proces wytwarzania jest bezpieczny.
Preparaty te można stosunkowo
szybko modyfikować i dostosowywać
do ewentualnych zmian cech
patogennego organizmu.

Szczepionki wytwarzane

metodami inżynierii

genetycznej

• Do wytwarzania szczepionek używa się
• ---organizmów patogennych nieodwracalnie

osłabionych przez delecję określonych

genów

• ---wektorów pochodzenia wirusowego

zrekombinowanych z genami kodującymi

immunogenne białka organizmu

patogennego

• ---preparatów immunogennych peptydów i

białek uzyskanych metodami inżynierii

genetycznej

• Obecnie przyjmowany podział obejmuje :

1. Szczepionki konwencjonalne

- szczepionki atenuowane (np szczepionka

Sabina na poliomielitis)

- szczepionki inaktywowane (np szczepionka

konwencjonalna na wirusa wścieklizny)

- szczepionki podjednostkowe (np anty-HBV,

PneumoShot na Streptococcus pneumoniae,

HiB na

Hemophilus influenzae)

- anatoksyny

• 2. Szczepionki rekombinowane

- szczepionki delecyjne (np na chorobę

Ajueszky'ego świń)

- szczepionki wektorowe (nowa szczepionka

przeciw wściekliźnie oprata na wektor vaccina,

szczepionka przeciw RHDV)

- szczepionki rekombinowane podjednostkowe

(produkowany w systemie drożdżowym HBsAg,

szczepionka na FMDV, szczepionka na grypę

FluBLOCK)

- szczepionki rekombinowane peptydowe

• 1. Szczepionki zawierające żywe

atenuowane drobnoustroje
(atenuacja przez wprowadzenie do
genomu ściśle określonych mutacji
delecyjnych).

• Przykłady :

- szczepionki przeciwko Salmonella
typhi.

• Przykłady :

• - nowa szczepionka antykrztuścowa

• - fragment genu Clostridium tetani kodujący

domenę toksyny odpowiedzialną za jej

immunogenność sklonowano w komórkach

E.coli

• - szczepionka przeciwko wirusowi żółtaczki

Hepatitis B produkowana w komórkach

drożdży dzięki ekspresji antygenu otoczki

wirusowej : gen białka otoczki został

wstawiony w wysokokopijny wektor drożdżowy

, wirusowe białko było produkowane w dużej

ilości.

• 3. Profilaktyka genowa tzw. III generacja

szczepionek :

• - podanie czystego genu - "nagie"

szczepionki.

• Przykłady :
• - wstrzyknięcie do mięśni szkieletowych

DNA wirusa grypy w formie plazmidu

indukuje powstanie specyficznych

cytotoksycznych limfocytów T.

Document Outline