MIKROBILOGIA 30VI2014 WIRUSOLOGIA

Ogólne informacje o wirusach:

1. Bardzo drobne rozmiary, 10-400nm

2. Zakaźne cząsteczki organiczne, nie posiadają struktury komórkowej

3. Posiadają tylko 1 rodzaje kwasu nukleinowego – DNA lub RNA

4. Nie rosną, nie rozmnażają się, nie wykazują metabolizmu

5. Zdolne do namnażania się tylko we wnętrzu komórek

6. Zakażają komórki prokariotyczne i eukariotyczne

7. W czasie rozwoju ulegają przemianie w formę niezakaźną (faza eklipsy) – niezbędne stadium namnażania

8. Dwie postaci:

   1. Wewnątrzkomórkowy – wegetatywna forma niezakaźna

   2. Pozakomórkowy – spoczynkowy, forma zakaźna – wirion

9. Do rozwoju wykorzystują białka komórki, w której się namnażają

Budowa wirusów:

1. Znaczne różnice w wielkości i kształcie

2. Kwas nukleinowy: DNA lub RNA – 1- lub 2-niciowy, liniowy lub kolisty, RNA o dodatniej lub ujemnej polarności, co ma związek ze sposobem po-wielania, u tych o dodatniej pomijana jest transkrypcja, nie jest potrzebna

3. Materiał genetyczny ograniczony do minimum, tylko niezbędne geny

4. Białkowy kapsyd, płaszcz, z jednakowych podjednostek (kapsydomerów)

5. Kwas i kapsyd tworzą razem nukleokapsyd

6. U niektórych dodatkowo otoczka – dwuwarstwa lipidów i białka, najczęś-ciej zabierają fragment błony w czasie uwalniania się z komórki gospo-darza, białka natomiast zawsze pochodzą od wirusa

7. Niektóre zawierają enzymy odgrywające rolę w procesie zakażania, zazwy-czaj wykorzystują enzymy gospodarza, ale mogą posiadać enzymy, które są im niezbędne np. odwrotna transkryptaza u retrowirusów, hemaglutynina i neuraminidaza u wirusa grypy niezbędne do wnikania do komórek i wychodzenia z nich

Symetria wirusów:

1. K ubiczna, dwudziestościenna, iksosaedralna:

   1. Na zewnątrz kapsyd w postaci 20-ścianu

   2. Wewnątrz kwas nukleinowy

   3. Nagie lub z otoczką

2. Helikalna

   1. K apsomery nanizane na łańcuch kwasu nukleinowego

   2. Całość skręcona w helisę (nukleokapsyd)

   3. Nagie lub otoczkowe

3. Złożona – kilka części o różnych kształtach i symetriach, np. niektóre bakteriofagi

Zasady BHP W LABOLATORIUM WIRUSOLOGICZNYM:

1. Zaostrzone, większe ryzyko – zakaźne aerozole:

   1. Oddzielne pomieszczenia, z własną śluzą sanitarną

   2. Oddzielny sprzęt laboratoryjny

   3. Praca pod komorą laminarną (filtry HEPA)

   4. Odzież ochronna, fartuch, rękawiczki, gogle, maska, czepki na włosy, kombinezon

   5. Unikanie ryzykownych zachowań – tarcie oczu, ust, żucie gumy

   6. Po pracy mycie i dezynfekcja powierzchni roboczych i pomiesz-czeń

   7. Sterylizacja narzędzi

Pobieranie i przesyłanie, przechowywanie materiałów do badań:

Diagnostyka wirusologiczna jest trudniejsza, ale również bazuje na:

• Stwierdzeniu obecności wirusa w pobranym materiale

• Stwierdzeniu odpowiedzi immunologicznej zakażonego organizmu

• Konieczne:

  • Dobór odpowiedniego materiału, np. z miejsca zmienionego chorobowo

  • Pobranie w odpowiednim czasie, głównie przy pierwszych objawach albo 2-3 tygodnie później

  • Odpowiednie warunki transportu i przechowywania materiału

Pobieranie i transport:

• Jałowe naczynia i sprzęt

• Podłoża transportowe, najczęściej płynne, z dodatkiem streptomycyny, penicy-liny i środków przeciwgrzybicznych np. amfoterycyna B

• Pośmiertnie – możliwość inaktywacji, rozwój bakterii, wirusy sieroce, trzeba uważać na zanieczyszczenie treścią przewodu pokarmowego

• Niektóre są bardzo wrażliwe na gnicie

• Podejrzenie zanieczyszczenia bakteriologicznego

  • Antybiotyki

  • Eter etylowy – 10-15%, nie wolno go stosować przy wirusach otocz-kowych, bo rozpuszcza lipidy

  • 50% roztwór glicerolu w płynie fizjologicznym

  • Filtry – specjalne pory lub tworzywo

  • Wirowanie 3000/minutę, zazwyczaj z chłodzeniem, bo są wrażliwe na wyższą temperaturę

• Przy pobieraniu krwi – nie mrozić, nie przepuszczać przez igłę – hemoliza!, zhemolizowane erytrocyty są szkodliwe dla próby

• Opakowanie:

  • Ochrona przez światłem, temperaturą, UV, niektóre są bardzo wrażliwe, najlepiej – termosy z lodem, lodówki turystyczne

  • Próby zabezpieczone, opisane, pismo przewodnie

• Przechowywanie prób do badań:

  • Możliwość mrożenia -25 do -70oC, do kilkunastu dni

  • Wirusy wrażliwe w 4oC

  • Liofilizacja – dla wirusów standardowych do badań

  • Mrożenie w ciekłym azocie do wirusów standardowych

  • Do konserwacji nie stosuje się środków chemicznych (wyjątkowo glicerol) – toksyczne dla podłóż biologicznych

TOK:

• Stwierdzenie obecności wirusa w materiale:

  • Bezpośrednio w materiale:

    • Mikroskopia – świetlna lub elektronowa, szukamy ciałek wtrę-towych w komórkach zakażonych, miejsca o zmienionej barw-liwości w cytoplazmie np. przy wściekliźnie, w jądrze komór-kowym, skupiska wirusów potomnych, blizny w komórce, „fab-ryki” wirusów, w elektronowym (barwienie kwasem fosforo-wolframowym) szukamy wirusów, stosujemy ją tylko gdy jest bardzo dużo cząsteczek wirusów np. przy opryszczce

    • Immunomikroskopia – z dodatkiem surowicy, przeciwciała zle-piają wirusy, umożliwia to identyfikację

    • Odczyny serologiczne, z zastosowaniem koniugatów, ELISA

    • Odczyny enzymatyczne do stwierdzenia obecności wirusów o-toczkowych posiadających hemaglutyninę

    • Hybrydyzacja – sonda genetyczna, fragment DNA komplemen-tarny do materiału genetycznego wirusa

  • Pośrednio – zakaża się próbę komórek materiałem, zakażanie podłóż biologicznych, musi zawierać żywe komórki, np. zwierzęta doświad-czalne, zarodki kurze, hodowle komórkowe, nie jest to metoda identy-fikacji

• Izolacja i namnażanie wirusa do dalszych badań, wykorzystuje się podłoża biologiczne

• Identyfikacja (serologiczna, hybrydyzacja)

• Badanie serologiczne – uzupełnienie toku, przeglądy stad, epizootiologia, epi-demiologia, badanie skuteczności szczepień

• Nie ma antybiogramu

Zarodki kurze jako podłoże biologiczne:

• Do izolacji i namnażania wirusów potrzebne są podłoża:

  • O dużej wrażliwości

  • Intensywnym metabolizmie

  • Szybkich podziałach komórkowych

• Najczęściej wykorzystuje się oseski ssaków lub zarodki kurze

• Zalety zarodków kurzych:

  • Metoda tania i prosta

  • Nie wymaga klatek, pomieszczeń, żywienia, personelu

  • Naturalna izolacja – skorupa, warstwa mucyn, mogą obok siebie stać zarodki zakażone różnymi wirusami

  • Trzy listki zarodkowe – tropizm wirusa, nie ma takiej możliwości w hodowli komórkowej

  • Komórki dobrze odżywione o wysokim tempie metabolizmu

• Wady zarodków:

  • Dobór zarodków do badań (SPF)

  • Nie jest to podłoże uniwersalne – bariera gatunkowa

  • Hodowla wirusów w zarodku kurzym może zmienić niektóre jego właściwości – utrata zjadliwości np. przy wirusie grypy

• Wybór jaj:

  • Fermy pod stałą kontrolą weterynaryjną

  • Wolne od chorób wirusowych, bo wirusy mogą się znaleźć w jajku, mo-że to wprowadzić w błąd przy badaniu, zjawisku interferencji – nieswo-ista odpowiedź na obcy kwas komórkowy, zabezpiecza przed zakaże-niem drugim wirusem, przeciwciała w jajku (żółtku)

  • Jaja od niosek SPF – wolne od drobnoustrojów chorobotwórczych

  • Nioski nieszczepione przeciwko wirusom, które chcemy oznaczać

  • Uwzględnianie czynników genetycznych

  • Uwzględnienie ubytków – trzeba kupić więcej jaj

  • Jaja świeże, przechowywanie maksymalnie 5 – 10 dni w temperaturze 10 – 12oC, nie ma wtedy podziałów, spowolniony metabolizm

  • Jaja średnie, prawidłowe skorupki i kształt, czyste, bo nie będzie się pra-widłowo rozwijał zarodek, najlepsze białe skorupki, bo łatwo się prześ-wietla

  • Nie wolno ich myć, bo usuwa się warstwę mucyn! Można w 3% for-malinie zanurzyć.

• Inkubacja zarodków:

  • Temperatura 37,5-38,5oC, niższa na kilka godzin przez np. brak prądu nie szkodzi, ale przegrzanie jest bardzo szkodliwe

  • Wilgotność 50-70%

  • Obracanie minimum 2 razy dziennie, jaj gadów nie wolno obracać! Żółtko jest bardzo ciężkie, może przygnieść zarodek

  • Wentylacja i mieszanie powietrza, potrzebują dużo tlenu

• Prześwietlanie 3-5 dzień inkubacji, żeby zobaczyć, czy w ogóle jest zarodek oraz w dniu inokulacji, zakażania

• Wybór drogi zakażenia zależy od:

  • Tropizmu wirusa

  • Wymagań wzrostowych wirusa

  • Calu badania (diagnostyka, namnażanie)

• Zakażanie:

  • W zależności od wirusa między 5-15 dniem inkubacji

  • Prześwietlając zaznaczamy ołówkiem miejsce, gdzie będzie wprowa-dzony wirus, odkażamy alkoholem, borujemy otwór w skorupce wapien-nej, ale nie naruszyć błony pergaminowej, otwór zalepiamy parafiną

  • Po zakażeniu jaja trafiają z powrotem do inkubatora

  • Przy niektórych metodach zakażania jaj już ich nie obracamy

• Do podświetlania – światło LED, bo się nie nagrzewa

• Drogi zakażania:

  • Błona kosmówkowo-omoczniowa – wirusy dermatotropowe – oprysz-czka, krowianka, przyszczyca, ospa; 7-8 dniowe, inkubuje się je przy zmniejszonej wilgotności, oznacza się komorę powietrzną, wycina się trójkąt w skorupce, wprowadza się płyn fizjologiczny i nacina się osłon-kę pergaminową – powoduje to, że komora powietrzna jest ruchoma

  • Doomoczniowa – w celu namnażania dużej ilości wirusa do dalszych ba-dań – zaznaczamy komorę powietrzną, zakażenie 0,5 cm poniżej komory od strony zarodka, nie można trafić w naczynie krwionośne, zarodki 9-12 dni, igłę kierujemy ku środkowi

  • Doowodniowo – wirusy pneumotropowe – grypa, parainfluenza, można odciąć skorupkę nad komorą powietrzną a błonę pergaminową prześwie-tlamy parafiną

  • Dożółtkowo – gdy chcemy wprowadzić dużo materiału, do 1ml, zarodki 5-6 dniowe, bo potem woreczek żółtkowy jest coraz mniejszy, dziura w połowie jaja naprzeciwko zarodka

  • Domózgowo – wirusy neurotropowe, np. wścieklizny, odcina się kaptu-rek nad komorą powietrzną

• Obserwacja:

  • Prześwietlanie 2 razy dziennie

  • Czas obserwacji zależy od rodzaju wirusa i jego dawki

  • Zarodki obumarłe sekcjonujemy

  • Jeśli wirus nie zabija, zarodki sekcjonujemy po inkubacji

  • Brak zmian nie wyklucza obecności wirusa – pasaże tzw ślepe, przywra-cają zjadliwość

• Zmiany w zarodku:

  • Śmierć

  • Wybroczyny – podskórne, brodawki piór, okolica potyliczna

  • Przekrwienia

  • Zahamowanie rozwoju, ocenia się długość śródstopia

  • Skręcenie zarodka

  • Zmniejszenie ilości płynu owodniowego lub omoczniowego

  • Zgrubienie i obrzęk błony kosmówkowo-omoczniowej

  • Ogniska nekrotyczne, strefy nacieków leukocytarnych

  • Zmiany histopatologiczne – ciałka wtrętowe

• Nie jest to metoda identyfikacji!!!

• Do dalszych badań pobieramy zakażone struktury i te zmienione chorobowo