PODSTAWY MIKROSKOPII

Podstawy optyki geometrycznej

Promień świetlny to bardzo wąska wiązka światła której oś wyznacza kierunek rozchodzenia się energii promienistej.

Prawo odbicia światła kąt padania jest równy kątowi odbicia a promień padający, odbity i normalna leżą w jednaj płaszczyźnie.

Prawo odbicia jest wykorzystywane w światłowodach. Energia nie jest utracona tylko jest przeprowadzana na zasadzie wielu odbić.

Soczewka to ciało przezroczyste ograniczone dwoma powierzchniami sferycznymi(lub innego rodz. ):

• Soczewka skupiająca – działa skupiająco jeżeli w środkowej części jest grubsza niż na brzegach

• Soczewka rozpraszająca – rozprasza promienie jeżeli w środkowej części jest cieńsza niż na brzegu

Aberracja sferyczna – wada związana z kątem rozwarcia wiązek padających. Soczewka nie skupia promieni w jednym miejscu tzn. obrazem punktu nie jest jeden punkt.

Aberracja chromatyczna – wada związana z rozszczepieniem światła przy załamaniu, czyli wynikająca z faktu że współczynnik załamania n jest funkcją częstotliwości (barwy)padającego promieniowania. Soczewka załamując promienie wywołuje barwną plamę.

Powiększenie – stosunek wielkości obrazu do przedmiotu.

P = gdzie P- powiększenie y – odl obrazu od soczewki x – odl przedmiotu od soczewki

Równanie soczewki – określa zależność pomiędzy odległością przedmiotu od soczewki a odległością jego obrazu otrzymanego w tej soczewce.

+ = y – odl obrazu od soczewki x – odl przedmiotu od soczewki f – ogniskowa

Zdolność skupiająca soczewki – wielkość określana dla pojedynczych soczewek i dla układów soczewek oznaczająca odwrotność ogniskowej. Wyrażana jest w dioptriach. Przyjmuje wartości dodatnie dla soczewek skupiających oraz ujemne dla rozpraszających.

Z =

Lupa – najprostszy przyrząd soczewkowy. Jeżeli przedmiot ustawimy między ogniskiem a soczewką to powstanie obraz powiększony, pozorny, prosty.

Mikroskopy

optyczne nieoptyczne

ś wiatło biologiczne elektronowe źródło

przechodzące protonowe , jonowe

ś wiatło polaryzacyjne skaningowe

odbite stereoskopowe tunelowe sposób pomiaru

sił atomowych

Mikroskop optyczny

Może wykorzystywać światło naturalne, dostarczane do układu optycznego przez specjalne lusterko lub wykorzystywać sztuczne światło, którego źródło znajduje się zazwyczaj pod analizowaną próbką. Mikroskopy ze sztucznym źródłem światła bywają nazywane mikroskopami świetlnymi, większość profesjonalnych mikroskopów optycznych posiada jednak współcześnie możliwość pracy z użyciem światła naturalnego i sztucznego.

W biologii są stosowane np.: do obserwacji drobnoustrojów i budowy tkanek. W chemii i fizyce są stosowane do obserwacji np.: przemian krystalicznych. W geologii są stosowane do obserwacji budowy skał.

W swojej budowie zawiera dwie soczewki skupiające: obiektyw – soczewka bliżej przedmiotu i okular – dalej od przedmiotu (to przez co patrzymy)

Powiększenie

P =

ze względu na obecność dwóch soczewek powiększenie w mikroskopie liczymy jako iloczyn powiększeń obu soczewek czyli :

P = P_okularu * P_obiektywu

P = L – długość tubusa (odległość pomiędzy okularem a obiektywem)

d – odległość dobrego widzenia f – długość ogniskowych

Zdolność rozdzielcza

To minimalna odległość między dwoma punktami obrazu kiedy te dwa punkty możemy rozróżnić jako oddzielne. Urządzenie optyczne mające dużą zdolność rozdzielczą rozróżnia dwa punkty leżące blisko siebie.

D = - długość fali światła n – współczynnik załamania – apertura numeryczna

Apertura numeryczna (NA)

Miara zdolności rozdzielczej obiektywu mikroskopu, zaznaczana na obudowie obiektywu. Zależy od maksymalnego kąta rozwarcia promieni świetlnych trafiających do obiektywu oraz od współczynnika załamania światła (n) na drodze między obiektywem i obserwowanym obiektem.

Dla przyrządów optycznych opisana jest wzorem:

NA =

n – współczynnik załamania w którym znajduje się przyrząd

- polowa maksymalnego kąta pod którym światło może padać z punktu P na przyrząd

W mikroskopie NA ogranicza możliwą do otrzymania rozdzielczość. Używa się cieczy immersyjnych o dużym współczynniku załamania pomiędzy próbką a obiektywem.

Fale de Broglie’ a

Broglie wysnuł hipotezę, że dualizm korpuskularno – falowy jest zjawiskiem powszechnym. Według niego z każdą cząstka materialną (np. elektron proton) poruszającą się jest skojarzona fala płaska, której parametry falowe (v, ) są związane z wielkościami E(energia) i p(pęd) cząstki. Długość fali skojarzoną z poruszającą się cząsteczką wyrażamy wzorem:

h- stała Planca (6,6*10^-34 J*s) v – prędkość m – masa

Fale materii wprowadzone przez Broglie’a nie mają nic wspólnego z falami elektromagnetycznymi !!!

M ikroskop elektronowy

Zasada dzialania sprowadza się do nadania wiązce elektronów uzyskanej dzięki termoemisji, energii i skierowanie jej na cienką warstwę badanego materiału. Elektrony przechodzą przez tę warstwę z małą stratą energii. Podczas przenikania przez materię elektrony ulegają ugięciu. Ugieta wiązka elektronow przechodzi dalej przez odpowiednio dobrane co do kształtu i rozkładu natężeń obszary pól magnetycznych i elektrycznych, stanowiących tzw. Soczewki elektronowe. Działają podobnie jak soczewka obiektywowa i okularowa w mikroskopie optycznym wytwarzają powiększony elektronowy obraz przedmiotu na fluoryzującym ekranie. Mikroskopy takie są stosowane głównie w badaniach krystalograficznych, biologicznych i medycznych na poziomie atomowym.

Załamanie wiązki elektronów jest analogią do prawa załamania w optyce.

Mikroskop fluorescencyjny

F luorescencja – padający foton wzbudza elektron w cząsteczce lub atomie. Wzbudzenie to wiąże się z przejściem elektronu do wzbudzonego stanu singletowego. Przy przejściu elektronu ze wzbudzonego stanu singletowego do stanu podstawowego następuje emisja światła. Długość fali promieniowania (wyemitowanego światła) jest dłuższa od długości fali zaabsorbowanej. Wynika to z degradacji części energii podczas przejść termicznych i bezpromienistych. Jest to tzw. przesunięcie Stokesa. Jest procesem odwrotnym do absorpcji.

Absorpcja elektronowa – proces polegający na pochłonięciu energii przez atom bądź cząstkę. Energia może zostać pochłonięta tylko w określonych porcjach. Są one równe odległością (w skali energii) pomiędzy poszczególnymi poziomami. W przypadku promieniowania z zakresu widzialnego proces absorpcji zachodzi zawsze od poziomu podst. do wyższych poziomów.

Z asada działania:

1. Filtr wzbudzenia

2. Filtr barierowy

Do barwienia komórek używa się znaczników fluorescencyjnych które są wykrywalne dzięki mikroskopowi. Światło przechodzi przez dwa zestawy filtrów. Zestaw pierwszy (1) filtruje światło przed jego dotarciem do preparatu, przepuszczając tylko te długości fali, które pobudzają odpowiedni znacznik fluorescencyjny. Zestaw drugi (2) zatrzymuje to światło, a z kolei przepuszcza tylko te długości fal, które są emitowane przez znacznik fluorescencyjny. Znakowane obiekty ukazują się w jasnym kolorze na ciemnym tle. Sposób ten używany jest w biologii molekularnej, gdyż pozwala, poprzez znajomość oddziaływań, na wyznakowanie interesujących elementów komórki (np. białek, czy organelli).

Mikroskop polaryzacyjny

Działanie mikroskopu polaryzacyjnego jest oparte na zjawisku dwójłomności substancji, w których występuje dalekozasięgowe uporządkowanie cząsteczek. Mikroskop ten posiada między okularem i źródłem światła dwa filtry polaryzacyjne. Jeden z nich jest nazywany polaryzatorem i znajduje się między źródłem światła i analizowaną próbką, a drugi jest nazywany analizatorem i znajduje się między próbką a tubusem. Polaryzator i analizator przepuszczają tylko tę część światła, która ma ściśle określoną polaryzację. W trakcie obserwacji są one skręcone względem siebie o 90° (są skrzyżowane), co powoduje, że jeśli próbka nie powoduje zmiany stanu polaryzacji światła, to nie może ono przejść przez cały układ. Jeśli próbka jest dwójłomna, to wówczas przynajmniej część światła przechodzi przez analizator i dociera do oka obserwatora lub detektora. Płaszczyznę polaryzacji analizatora można zmieniać uzyskując wygaszanie jednych obszarów i rozjaśnienie innych. Towarzyszą temu zazwyczaj efekty barwne, ze względu na to, że zmiana stanu polaryzacji jest różna dla różnych długości światła. Mikroskop polaryzacyjny stosowany jest m.in. do badania: skał, minerałów, kruszców, preparatów biologicznych, struktury komórek i tkanek, w metalografii, w przemyśle szklarskim i włókienniczym. Zastosowanie znalazł również w badaniu ciekłych kryształów.

Mikroskop skaningowy

W mikroskopach skaningowych wiązka elektronów bombarduje próbkę, skanując jej powierzchnię linia po linii. Pod wpływem wiązki elektronów próbka emituje różne sygnały (m. in. elektrony wtórne, elektrony wstecznie rozproszone, charakterystyczne promieniowanie rentgenowskie), które są rejestrowane za pomocą odpowiednich detektorów, a następnie przetwarzane na obraz próbki lub widmo promieniowania rentgenowskiego. Obraz oglądany w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) nie jest obrazem rzeczywistym. To co widzimy w SEM jest obrazem wirtualnym skonstruowanym na bazie sygnałów emitowanych przez próbkę. Dzieje się to poprzez zeskanowanie linia po linii prostokątnego obszaru na powierzchni próbki. Umożliwia obserwację małych organizmów, określanie struktur i procesów wewnątrzkomórkowych, odnajdywanie i rozpoznawanie substancji chemicznych.

Mikroskop sił atomowych

Twórcy pierwszego mikroskopu sił atomowych wpadli na pomysł, że do obrazowania powierzchni można by wykorzystać siły oddziaływania międzyatomowego. Występowanie sił magnetycznych, elektrostatycznych i oddziaływań międzyatomowych pomiędzy atomami ostrza i badanej powierzchni umożliwia wykorzystanie detekcji ruchów ostrza sunącego po powierzchni próbki do obrazowania tej powierzchni. Ostrze jest wytworzone na sprężystej mikrodźwigni (mikrobelce), której odchylenie umożliwia wyznaczenie siły oddziaływania międzyatomowego pomiędzy atomami ostrza i badanej powierzchni. Mapa sił dla każdego punktu powierzchni próbki jest przetwarzana komputerowo na obraz. Jeśli chce się do obrazowania wykorzystać siły magnetyczne, to ostrze pokrywa się materiałem magnetycznym. Na czubek ostrza składa się od kilku do kilkuset atomów. Za pomocą mikroskopu sił atomowych można uzyskać mikroskopowe mapy opisujące zarówno ukształtowanie powierzchni, jak i jej właściwości fizyczne, takie jak: tarcie, adhezja, rozkład ładunku elektrostatycznego, przewodność elektryczna. Przeprowadzenie pomiaru może być dokonane zarówno w powietrzu, jak i w cieczy czy w próżni. Dzięki temu np. w biologii staje się możliwe obrazowanie i badanie właściwości żywych komórek w ich naturalnym ciekłym środowisku. Mikroskop sił atomowych umożliwia badanie gładkości powierzchni stempli do wyrobów płyt kompaktowych.

Mikroskop interferencyjny

Wykorzystywane jest zjawisko interferencji fal świetlnych. Każdy promień świetlny wchodzący do mikroskopu zostaje podzielony na dwa, z których jeden przechodzi przez badany preparat. W części okularowej oba promienie spotykają się i interferują. Używamy ich tylko do oceny grubości powierzchni naniesionej na coś będącego podłożem. Preparat musi mieć wymiary podobne do długości fali. Warunkiem jest przezroczystość próbki dla światła o danej długości a współczynnik załamania podłoża musi być taki by światło nie przechodziło do niego (całkowite wewnętrzne odbicie).