KWASY NUKLEINOWE – ĆWICZENIA

Oznaczanie RNA metodą orcynową.

Ryboza pod wpływem stężonego kwasu solnego odwadnia się do furfuralu, który w obecności Fe³⁺ daje z oryną kompleks o barwie zielonej. Reakcję tę daje wolna ryboza, jej estry fosforanowe oraz ryboza nukleotydów i nukleozydów purynowych. Ryboza związana z pirymidynami nie tworzy tego kompleksu. Dlatego więc podczas ilościowego oznaczania RNA nie stosuje się jako wzorca wolnej rybozy, lecz standardowy roztwór RNA. Z oryną oprócz rybozy, reaguje także deoksyryboza, daje ona jednakże ok. 10-krotnie słabsze zabarwienie niż ryboza.

Postępowanie:
1ml roztworu zawierający 10-100μg RNA i 1ml odczynnika orcynowego zmieszać, wstawić do łaźni wodnej na 20 min i po oziębieniu uzupełnić wodą do 4ml.
Odczytać absorbancję dla 670nm wobec ślepej próby odczynnikowej.
Wykonać pomiar absorbancji dla 100μg RNA standardowego oraz próby badanej.
Obliczyć stężenie RNA w 1ml badanego roztworu stosując przeliczenie:

Kwasy nukleinowe, nukleotydy, nukleozydy i wolne zasady azotowe pochłaniają światło ultrafioletowe w zakresie długości fal od 249nm do 276nm. Odpowiedzialne za to są wiązania podwójne w pozycji sprzężonej oraz heteroatomy w pierścieniach zasad purynowych i pirymidynowych. Pozostałe elementy struktury kwasów nukleinowych – grupa fosforanowa, cukier ryboza lub deoksyryboza nie wpływają na zakres pochłaniania światła ani na jego intensywność. Poszczególne zasady azotowe mają różniące się nieznacznie maksima absorbancji światła i tak: guanina posiada maksimum absorbancji przy 249nm, adenina przy 265,5nm, uracyl przy 260nm, cytozyna przy 276nm. Tymina przy 265nm. Różnią się one także wyraźnie intensywnością pochłaniania światła w swoich maksimach, co uwidacznia się w molowych współczynnikach absorbancji poszczególnych zasad. Wygląd krzywych widma absorbancji poszczególnych zasad purynowych i pirymidynowych zależy od pH środowiska, w którym aktualnie dokonujemy wyznaczania widma. Kwasy nukleinowe posiadają kombinację wszystkich zasad azotowych, dlatego też mają maksimum przy średniej długości fali dla poszczególnych zasad azotowych – przy 260nm.

Efekt hiperchromowy jest to zwiększenie absorbancji w czasie denaturacji DNA. Mierząc absorbancję DNA natywnego, a następnie jego absorbancję po denaturacji termicznej, obserwujemy zwiększenie absorbancji DNA zdenaturowanego w stosunku do DNA w formie natywnej: A_{DNA nat.} < A_{DNA den.}
Efekt ten związany jest ze zmianą gęstości optycznej DNA w trakcie denaturacji (zmienia się także skręcalność optyczna, lepkość i współczynnik sedymentacji DNA).
Wartość charakterystyczna dla procesu denaturacji termicznej DNA to temperatura topnienia DNA, czyli temperatura, w której połowa DNA zostaje jeszcze w formie natywnej, a połowa jest już w formie denaturowanej. Im więcej par G C o potrójnym wiązaniu wodorowym w dwuniciowym DNA tym temperatura topnienia jest wyższa, ponieważ trzeba dostarczyć więcej energii na zerwanie potrójnych wiązań wodorowych niż podwójnych A=T.

Wyznaczanie widma absorpcyjnego kwasów nukleinowych.
Zmierzyć absorbancję próbki DNA wobec wody w zakresie długości fal od 220nm do 300nm (co 10nm). I wykreślić zależność A od λ.

Oznaczanie efektu hiperchromowego.
Podgrzewając roztwory DNA we wrzącej łaźni wodnej dokonujemy jego denaturacji termicznej. Stopniowe ochłodzenie zdenaturowanego DNA do temperatury pokojowej powoduje jego denaturację. Gwałtowne ochłodzenie DNA w łaźni lodowej utrwala formę denaturowaną.

Postępowanie:
Roztwór DNA dzielimy na 2 części i umieszczamy w 2 probówkach zamkniętych korkami z chłodniczkami. Probówki umieszczamy na 10min we wrzącej łaźni wodnej. Jedną z probówek pozostawiamy do powolnego ochłodzenia w temperaturze pokojowej. Drugą probówkę gwałtownie chłodzimy w łaźni lodowej. Czytamy absorbcję obu prób w zakresie 220-300nm wobec wody co 10nm i rysujemy wykres obu widm. Wyliczamy wartość efektu hiperchromowego występującego przy λ=260nm.

Rozdział elektroforetyczny DNA oraz produktów jego enzymatycznej degradacji w 0,8% agrozie.

Elektroforeza w żelu agrozowym jest standardową metodą do rozdzielania, identyfikacji, a także oczyszczania DNA i jego fragmentów. Pasma DNA po elektroforezie są lokalizowane w żelu poprzez obserwację w świetle ultrafioletowym fluorescencji bromku etydyny wbudowanego w podwójną spiralę kwasu nukleinowego. Metoda ta pozwala wykryć obecność nawet tak małych ilości DNA jak 1ng na pasmo. Szybkość wędrówki DNA w agrozie podczas elektroforezy zależy od:
1) wielkości cząsteczki (szybkość wędrówki jest odwrotnie proporcjonalna od długości cząsteczek)
2) stężenia agrozy
3) konformacji DNA
4) napięcia prądu elektrycznego.

Stężenie agrozy w żelu [%]	Zakres rozdziału (kb = kilo base)
0,3	5-60
0,6	1-20
0,9	0,5-7
1,2	0,4-6
2,0	0,1-3

Szybkość migracji liniowych fragmentów DNA jest proporcjonalna do napięcia tylko dla jego stosunkowo niskich wartości, dlatego więc do otrzymania najlepszego rozdziału fragmentów większych niż 2kpz nie należy przekraczać napięcia 5V/cm. Zachowanie DNA w elektroforezie w żelu agrozowym nie zależy w istotny sposób od składu zasad azotowych. Szybkość poruszania się fragmentów DNA w agrozie nie zmienia się w dość szerokim zakresie temperatur (4-30stopni), w związku z tym wygodniej jest prowadzić ten sam proces w temperaturze pokojowej. Technika ta służy do rozdziału kwasów nukleinowych, kompleksów białek z kwasami nukleinowymi oraz dużych struktur białkowych. Zależnie od wielkości rozdzielanych struktur stosuje się odpowiednie stężenie agrozy, z czym wiąże się stopień jej usieciowania. Agroza jest polimerem polisacharydowym, utworzonym przez pochodne galaktozy. Elektroforezę przeprowadza się w pH ok. 7,0; w tych warunkach cząsteczki DNA są ujemnie naładowane, wędrują więc do anody.

Postępowanie:
Raczej wątpię, że będziemy przygotowywać żel agrozowy, więc to pominę – s.206.
Delikatnie (!!!!!) wyciągamy grzebień z agrozy. Próbki nanosimy „odwarstwiając” do studzienek wypełnionych buforem elektrodowym. Elektroforezę prowadzimy przy odpowiednim natężeniu prądu przez 1-2h. Wynik oglądamy w świetle UV – maska ochronna, rękawiczki, opuszczone rękawy fartucha!!!

Degradacja wysokocząsteczkowgo DNA różnymi ilościami DNazy.
We wcześniejszym podrozdziale (s.207) było o enzymatycznej degradacji, ale przecież umiemy to z przygotowań do egzaminu, jednakże robimy tylko DNazy, więc zasada metody będzie poniżej.
DNaza I jest enzymem endonukleolitycznym specyficznym względem dwuniciowego DNA. Wysokocząsteczkowy DNA jest degradowany (trawiony) przez DNazę I na coraz mniejsze fragmenty w miarę czasu trawienia reakcji lub dostępności enzymu. Jako rezultat trawienia uzyskujemy mieszaninę fragmentów DNA o różnej wielkości (długości), które w elektroforezie w żelu agrozoym mogą układać się w postaci zabarwienia ściężki nawet na całej jej długości.

Postępowanie:
Przygotować próby wg tabeli ze skryptu (s.208). Wszystkie próby inkubować 10 min w temp. 37 stopni, po czym dodać 10μl „stopera”. Wszystkie próbki nanieść na żel agrozowy. Elektroforezę prowadzić przez ok. godzinę przy 40mA/żel. Pasma DNA po elektroforezie lokalizować w żelu przez obserwację w świetle ultrafioletowym fluorescencji bromku etydyny wbudowanego w podwójną spiralę kwasu nukleinowego.

Izolacja DNA z komórek bakteryjnych.
W komórce prokariotycznej DNA występuje w cytoplazmie w postaci pojedynczego kolistego chromosomu bakteryjnego zwanego genoforem, wielkości 300-5000kb, niosącego kompletną informację o budowie i funkcjonowaniu komórek bakteryjnych. W obrębie genów bakteryjnych nie wyróżnia się intronów.
Poza chromosomem bakterie posiadają także w cytoplazmie kolisty DNA plazmidowy, który niesie dodatkowe informacje nie będące konieczne do funkcjonowania komórek bakteryjnych, korzystne jednak dla bakterii, takie jako odporność na antybiotyki np. gen kodujący laktamazę rozkładającą ampicylinę (wszystko jasne), właściwości chorobotwórcze, zdolność do wykorzystywania innych źródeł energii.
Informację genetyczną mogą stanowić: dwuniciowy DNA, jednoniciowy DNA lub RNA.

Preparacja kwasu rybonukleinowego z drożdży.
15ml buforu do ekstrakcji doprowadzić do wrzenia. Dodać 10g rozdrobnionych, świeżych drożdży o ogrzewać 3 mon. Schłodzić pod strumieniem zimnej wody, a następnie w łaźni lodowo-wodnej. Odwirować przez 10min przy 3 000 *g. Uzyskany supernatatn wlać do dwóch objętości oziębionego 95% etanolu i inkubować w zamrażarce 30 min (Przed włożeniem sprawdzić, czy lodówka jest podłączona ). Wirujemy ponownie 10 min. Osad rozpuścić w 5ml 0,01M NaOH. Mierzymy absorbancję przy 260nm. Określamy stopień czystości wykreślając widmo 230-300nm i obliczenie stosunku A260/A280. Do pomiarów spektrofotometrycznych RNA rozcieńczyć ok. 100 razy.

Próba Biala na pentozy.

Wolne pentozy, ich estry fosforanowe oraz ryboza związana w nukleozydach i nukleotydach purynowych, ogrzewane z kwasem solnym odwadniają się do furfuralu, który z orcyna i jonami Fe³⁺ daje zielono zabarwiony kompleks. Deoksyryboza oraz ryboza związane z zasadami pirymidynowymi dają bardzo słaby odczyn.

Próba Dischego na deoksyrybozę.

Deoksyryboza ogrzewana w środowisku silnie kwaśnym odwadnia się do furfuralu tworząc niebieski kompleks z difenyloaminą. Ryboza i inne pentozy nie dają tego odczynu.

2