Prace oryginalne

Mikol. Lek. 1998, 5 (1): 15-22

ISSN 1232-986X

Parametry wirulencji szczepów Candida albicans izolowanych

z ontocenozy pochwy pacjentek z kandydoz¹

Virulence parameters of Candida albicans strains isolated from women with vulvovaginitis

El¿bieta Krajewska-Ku³ak, Wiaczes³aw Niczyporuk

Klinika Dermatologii i Wenerologii AM w Bia³ymstoku

Badaniem objêto 112 szczepów Candida albicans izolowanych z ontocenozy pochwy pacjentek z przewlek³¹ nawrotow¹ kandy-

doz¹ pochwy. Celem pracy by³o wykazanie zale¿noœci pomiêdzy stanem klinicznym pacjentek a aktywnoœci¹ enzymatyczn¹

wyizolowanych grzybów dro¿d¿opodobnych, a tak¿e ich zdolnoœci¹ adherencji do nab³onka b³ony œluzowej policzka oraz

opornoœci¹ na leki. Stwierdzono, ¿e szczepy izolowane od pacjentek objawowych charakteryzowa³y siê w wiêkszoœci jednoczesn¹

aktywnoœci¹ lipolityczno-proteolityczn¹ (67,9%). Izolaty te wykazywa³y tak¿e znamiennie statystycznie wy¿sz¹ aktywnoœæ

badanych 19 hydrolaz, wiêksz¹ zdolnoœæ adherencji oraz zwiêkszon¹ opornoœæ na oceniane antymikotyki w porównaniu ze

szczepami posiadaj¹cymi tylko aktywnoœæ lipolityczn¹ lub proteolityczn¹. Uzyskane wyniki sugeruj¹, ¿e w przypadku szczepów

o aktywnoœci lipolityczno-proteolitycznej wystêpuje wy¿sza aktywnoœæ hydrolityczna, wiêksza zdolnoœæ adherencji do nab³onka

b³ony œluzowej jamy ustnej oraz wzmo¿ona opornoœæ na antymikotyki. Mo¿e to przemawiaæ za zwiêkszon¹ zjadliwoœci¹ tych

szczepów i byæ przyczyn¹ nawrotowego charakteru kandydozy.

S³owa kluczowe: Candida, dro¿d¿yca pochwy, aktywnoœæ enzymatyczna, adherencja, opornoœæ na leki

przeciwgrzybicze

112 strains Candida albicans isolated from women with chronic vulvovaginitis were tested. The aim of this study was the

evaluation of the relationship between the enzymatic activity of the yeast-like fungi and their adherence to human buccal

epithelial cells and resistance to tested antimycotics. Proteolytic activity of Candida albicans isolates using Steib’s medium and

lipolytic activity using Werner’s medium were assessed. Enzymatic activity of the hydrolases of isolates using API ZYM (bioMérieux)

was determined. In vitro, adherence of the yeast-like fungi to human buccal epithelial cells from healthy volunteers who did not

used any drugs during last three months was tested. It was found that 6.25% of isolates from women with vulvovaginitis had lipolytic

activity – group I, 19.6% of isolates had proteolytic activity – group II and 67.9% of isolates had lipolytic-proteolytic activity –

group III. Isolates of group I had the highest activity of lipase, esterase lipase, esterase, whereas 5 hydrolases had no enzymatic

activity. Isolates of group II had the highest hydrolytic activity of esterase lipase, leucine arylamidase, esterase and 6 hydrolases

had no enzymatic activity. Isolates of group III had the highest activity of leucine arylamidase, esterase lipase, esterase and

3 hydrolases had no activity. In adherence test, to 1 human buccal epithelium cell 25.06±1.04 of the yeast cells of group I,

39.16±1.54 of yeast cells of group II, and 48.26±1.24 of yeast cells of group III were adherenced. Isolates with proteolytic-lipolytic

activity had significantly higher activity of tested hydrolases, higher adherence and resistance to tested antimycotics compared

with isolates with the lipolytic or proteolytic activity. Our findings suggest that high virulence of the tested isolates may be

a factor of chronic vulvovaginitis in women.

Key words: Candida, candidiasis of vagina, enzymatic activity, adherence, resistance to antimycotics

Wstêp

Grzybica pochwy jest jedn¹ z najczêstszych po-

staci grzybic. Niektórzy autorzy uwa¿aj¹, ¿e co

czwarty przypadek zapalenia pochwy jest spowodo-

wany infekcj¹ grzybicz¹. U oko³o 40-50% pacjentek

kandydoza pochwy ma charakter nawracaj¹cy. Naj-

czêstszym czynnikiem etiologicznym grzybicy po-

chwy i sromu jest gatunek Candida albicans (70-95%

wszystkich grzybic). W ostatnich latach w literaturze

podkreœla siê tak¿e rolê innych gatunków grzybów

mog¹cych powodowaæ zapalenie sromu i pochwy.

15

16

El¿bieta Krajewska-Ku³ak, Wiaczes³aw Niczyporuk

Mikol. Lek. 1998, 5 (1)

Wymieniæ tu nale¿y takie gatunki grzybów dro¿d¿o-

podobnych, jak: Candida glabrata (oko³o 5%), Candida

krusei, Candida kefyr, Candida parapsilosis, Candida

tropicalis oraz Saccharomyces cerevisiae, Geotrichum

i inne drobnoustroje (np. Gardnerella vaginalis, Chlamy-

dia trachomatis) (5, 7, 23, 27, 28).

Grzyby zaliczamy do patogenów oportunistycznych.

Poszczególne gatunki, a nawet ró¿ne szczepy, charak-

teryzuj¹ siê odmienn¹ wirulencj¹. Wyst¹pienie grzybicy

jest wynikiem interakcji, jaka zachodzi pomiêdzy orga-

nizmem gospodarza a danym drobnoustrojem. Wstêp-

nym etapem zaka¿enia jest przyleganie (adherencja)

grzyba do b³ony œluzowej gospodarza, a zdolnoœæ do

adhezji jest uwa¿ana za jeden z objawów wirulencji.

Do innych objawów zalicza siê tak¿e zdolnoœæ do pro-

dukcji proteaz oraz wytwarzanie opornoœci na leki

przeciwgrzybicze.

Celem pracy by³o wykazanie zale¿noœci pomiêdzy

stanem klinicznym pacjentek a aktywnoœci¹ enzyma-

tyczn¹ grzybów dro¿d¿opodobnych, a tak¿e ich zdol-

noœci¹ adherencji do nab³onka b³ony œluzowej policzka

oraz opornoœci¹ na leki.

Materia³ i metody

Materia³ do badañ stanowi³o 112 szczepów Can-

dida albicans izolowanych od pacjentek w wieku 18-

-75 lat z przewlek³¹, nawrotow¹ kandydoz¹ pochwy,

u których w leczeniu wielokrotnie stosowano ró¿ne

leki przeciwgrzybicze ogólnie i miejscowo. Materia³

do badania pobierano ja³ow¹ wymazówk¹ i posiewano

bezpoœrednio na p³ytki Petriego zawieraj¹ce pod³o¿e

Sabourauda. P³ytki inkubowano w temperaturze 37°C

w cieplarce w ci¹gu 72 godzin. Identyfikacji szczepów

dokonano wstêpnie na pod³o¿u Albicans ID, a nastêp-

nie ATB 32C AUX (bioMérieux). Ocenê aktywnoœci

proteolitycznej dokonano przy u¿yciu pod³o¿a Steiba

o sk³adzie: glukoza – 20 g, KH

2

PO

4

– 1 g, MgSO

4

–

0,5 g. Sk³adniki rozpuszczano ca³kowicie w wodzie

i ustalono pH na 7,2-7,3. Po ustaleniu pH dodawano

20 g sproszkowanego agaru (Bacto-agar) i rozpusz-

czano wszystko w aparacie Kocha, a nastêpnie wyja³a-

wiano w autoklawie przez 15 min przy ciœnieniu 0,8 atm.

W dalszej kolejnoœci przygotowywano roztwór 5% ka-

zeiny. Kazeinê rozpuszczano w wodzie z dodatkiem

1000 j/ml Penicyliny, 1000 µg/ml Streptomycyny. Roz-

twór kazeiny wyja³awiano w aparacie Kocha i przecho-

wywano w ch³odni. Nastêpnie na ka¿d¹ p³ytkê doda-

wano 2 ml 5% kazeiny z antybiotykami i wlewano na

ni¹ ja³ow¹ pipet¹ ok. 10 ml rozpuszczonego pod³o¿a

Steiba szybko mieszaj¹c (przechylaj¹c p³ytkê na stro-

ny lub wstrz¹saj¹c). Po wymieszaniu siê sk³adników

p³ytki pozostawiano do zastygniêcia agaru. Tak przy-

gotowane p³ytki, przed posiewem grzybów, podsuszano

w temperaturze 37°C przez 15-20 min. Szczepy wysie-

wano na p³ynne pod³o¿e Sabourauda i inkubowano

przez 24 lub 48 godzin w temperaturze 37°C tak, by za-

wiesina zawiera³a 10x10

7

komórek w 1 ml hodowli. Po-

Tabela I: Wartoœci aktywnoœci lipolitycznej i proteolitycznej szczepów Candida albicans izolowanych od pacjentek z objawow¹

kandydoz¹ pochwy

Table I: Values of the lipolytic and proteolytic activity of Candida albicans strains isolated from women with vaginal candidiasis

Zakres wartoœci œrednic

Liczba szczepów

Liczba szczepów

Liczba szczepów

stref przejaœnienia w cm

z aktywnoœci¹ lipolityczn¹

z aktywnoœci¹ proteolityczn¹

z aktywnoœci¹

Range of mean values

Number of strains

Number of strains

lipolityczno-proteolityczn¹

of clearing up zone in cm

with lipolytic activity

with proteolytic activity

Number of strains

with lipolytic-proteolytic

activity

lipolityczna

proteolityczna

lipolytic

proteolytic

0,5

–

–

12

2

0,6

–

–

2

12

0,7

–

4

16

28

0,9

4

4

4

6

1,0

2

8

8

28

1,1

2

2

2

–

1,2

4

2

8

–

1,3

–

–

4

–

1,4

2

2

–

–

1,5

–

–

4

–

1,6

–

–

8

–

2,0

–

–

4

–

2,2

–

–

4

–

Razem szczepy n=112

14 (12,5%)

22 (19,6%)

76 (67,9%)

Strains total

Œrednia œrednica

przejaœnienia w cm

1,1±0,5

0,99±0,04

1,09±0,06

0,81±0,02

Mean diameter of

clearing up in cm

17

Parametry wirulencji szczepów Candida albicans izolowanych z ontocenozy pochwy pacjentek z kandydoz¹

bierano ja³ow¹ znormalizowan¹ ez¹ oczko p³ynnej za-

wiesiny i prowadzono w wyznaczonym sektorze liniê

d³ugoœci 2-2,5 cm. P³ytki z hodowl¹ inkubowano przez

48 lub 72 godz. w temperaturze 37°C. W przypadku

obecnoœci grzybów z rodzaju Candida albicans o w³aœ-

ciwoœciach proteolitycznych obserwowano wokó³ ich

kolonii strefê rozk³adu kazeiny i str¹cenia lub tylko

str¹cenia (w mm). Do oceny aktywnoœci lipolitycznej

u¿yto pod³o¿a Wernera o sk³adzie: pepton – 10 g, NaCl

– 5 g, CaCl

2

uwodniony – 0,4 g, woda destylowana –

1000 ml i pH ok. 7,4. Nastêpnie dodawano 20 g Bacto-

agaru i wszystko rozpuszczano w aparacie Kocha.

Przefiltrowywano przez bibu³ê i dodawano 10 ml Tween

80. W dalszej kolejnoœci wyja³awiano przez 20 min

w autoklawie przy ciœnieniu 0,9 atm. Przed rozla-

niem pod³o¿a na p³ytki dodawa-

no 1000 µg/ml Streptomycyny

i 1000 j.m. Penicyliny. Pod³o¿e

po rozlaniu na wyja³owione p³yt-

ki zostawiano do zastygniêcia.

Przed wykonaniem posiewu p³yt-

ki z pod³o¿em podsuszano przez

20 min w temperaturze 37°C.

Drobnoustroje i posiewy przygo-

towywano w identyczny sposób

jak do oceny aktywnoœci proteo-

litycznej. Odczytu aktywnoœci en-

zymatycznej dokonywano naj-

wczeœniej po 72 lub 96-120 godz.

W przypadku obecnoœci grzybów

z rodzaju Candida albicans wy-

kazuj¹cych w³aœciwoœci lipolitycz-

ne wokó³ kolonii obserwowano

strefy rozk³adu enzymatycznego

(mierzone w cm).

Ocenê aktywnoœci hydrolitycz-

nej przeprowadzano przy u¿yciu

testu API ZYM (bioMérieux),

zawieraj¹cego substraty do wy-

krycia 19 hydrolaz. Enzymy i ich

substraty przedstawia tabela II.

Z 24-godzinnych hodowli szcze-

pów Candida przy u¿yciu den-

sytometru przygotowywano w wo-

dzie destylowanej zawiesinê

o gêstoœci 5 stopni w skali Mc-

Farlanda. Odpowiedni¹ iloœæ tej

zawiesiny (65 mikrolitrów) prze-

noszono do kapsu³ek pasków API

ZYM, które inkubowano przez

4 godz. w temperaturze 37°C.

Po inokulacji dodawano po jed-

nej kropli ZYM A oraz ZYM B

i pozostawiano na kilka minut

w temperaturze pokojowej. Ak-

tywnoœæ enzymów okreœlano

w nanomolach hydrolizowane-

go substratu wed³ug intensyw-

noœci reakcji barwnej. Zgodnie

z zaleceniem producenta sto-

sowano skalê 5-stopniow¹ (od

0 do 5 stopni): 0 – 0 nanomoli,

1 – 5 nanomoli, 2 – 10 nano-

moli, 3 – 20 nanomoli, 4 – 30 nanomoli i 5 – powy¿ej

40 nanomoli.

Komórki nab³onkowe ze œluzówki policzków pobie-

rano przez pocieranie ja³ow¹ szpatu³k¹ od osób zdro-

wych, nie stosuj¹cych w ci¹gu ostatnich trzech miesiê-

cy ¿adnych leków ogólnych i miejscowych na œluzów-

kê jamy ustnej. Nab³onki wyp³ukiwano ze szpatu³ki na

wytrz¹sarce w 5 ml fizjologicznego roztworu soli przez

1 min oraz odwirowywano przy prêdkoœci 500 obro-

tów/min przez 5 min. Po odci¹gniêciu supernatantu

osad przep³ukiwano jeszcze dwukrotnie w tych sa-

mych warunkach, a nastêpnie do osadu dodawano

1 ml fizjologicznego roztworu soli o pH 7,0. Liczbê ko-

mórek nab³onkowych w 1 µl tej zawiesiny ustalano

w komorze Bürkera na oko³o 10

4

-10

5

/µl (ca³kowita

Numer enzymu

Nazwa enzymu

Hydrolizowany substrat

Number of enzyme

Name of enzyme

Hydrolized substrate

I

Fosfataza zasadowa

2-naftylofosforan

Phosphatase alcaline

2-naphthyl phosphate

II

Esteraza (C4)

2-naftylomaœlan

Esterase (C4)

2-naphthyl butyrate

III

Lipaza esterazowa (C8)

2-naftylokapronian

Esterase lipase (C8)

2-naphthyl caprylate

IV

Lipaza (C14)

2-naftylomirystylan

Lipase (C14)

2-naphthyl myristate

V

Arylamidaza leucynowa

L-leucylo-2-naftyloamid

Leucine arylamidase

L-leucyl-2-naphthylamide

VI

Arylamidaza walinowa

L-walinylo-2-naftyloamid

Valine arylamidase

L-valyl-2-naphthylamide

VII

Arylamidaza cystynowa

L-cystynylo-2-naftyloamid

Cystine arylamidase

L-cystyl-2-naphthylamide

VIII

Trypsyna N-benzylo-DL-arginino-2-naftyloamid

Trypsin

N-benzoyl-DL-arginine-2-naphthylamide

IX

a-chymotrypsyna N-glutarylo-fenyloalanino-2-naftyloamid

a-chymotrypsin N-glutaryl-phenyloalanine-2-naphthylamide

X

Fosfataza kwaœna

2-naftylofosforan

Acid phosphatase

2-naphthyl phosphate

XI

Naftolu-AS-BI-fosfohydrolaza Naftolu-AS-BI-fosforan

Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase

Naphtol-AS-BI-phosphate

XII

a-galaktozydaza 6-Br-2-naftylo-a-D-galaktopiranoza

a-galactosidase

6-Br-2-napthylo-

aD-galactopyranoside

XIII

b-galaktozydaza

2-naftylo-b-D-glukopiranoza

b-galactosidase

2-naphthyl-

bD-glucopyranoside

XIV

b-glukuronidaza Naftolu-AS-BI-b-D-glukuronid

b-glucuronidase

Naphthol-AS-BI-

bD-glucuronide

XV

a-glukozydaza

2-naftylo-a-D-glukopiranoza

a-glucosidase

2-naphthyl-

aD-glucopyranoside

XVI

b-gukozydaza 6-Br-2-naftylo-b-D-glukopiranoza

b-glucosidase

6-Br-2-naphthyl-

bD-glucopyranoside

XVII

N-acetylo-b-glukozyloamidaza

1-naftylo-N-acetylo-b-D-glukozyloamid

N-acetyl-

b-glucosamidase

1-naphthyl-N-acetyl-

bD-glucosamide

XVIII

a-mannozydaza

6-Br-2-naftylo-a-D-mannopiranoza

a-mannosidase

6-Br-2-naphthyl-

aD-mannopyranoside

XIX

a-Fukozydaza

2-naftylo-a-L-fukopiranoza

a-fucosidase

2-naphthyl-

aL-fucopyranoside

Tabela II: Zestawienie enzymów hydrolitycznych i ich substratów

Table II: The list of hydrolytic enzymes and their substrates

18

El¿bieta Krajewska-Ku³ak, Wiaczes³aw Niczyporuk

Mikol. Lek. 1998, 5 (1)

liczba komórek z jednego pobrania by³a rzêdu 10

7

-

-10

8

). Gêstoœæ zawiesiny dro¿d¿aków ustalano przy

u¿yciu densytometru na oko³o 108/µl. 1 ml zawiesiny

komórek Candida albicans i 1 ml komórek nab³onko-

wych inkubowano w temperaturze 37°C na rotorze

z prêdkoœci¹ 50 obrotów/min przy amplitudzie 7 przez

30 min. Próba kontrolna zawiera³a same komórki na-

b³onkowe zawieszone w roztworze fizjologicznym soli.

Po okresie inkubacji zawiesinê odwirowywano przez

3 min przy 500 obrotach/min w celu usuniêcia nieprzy-

legaj¹cych dro¿d¿aków. Z kilku kropli osadu wykony-

wano rozmaz na szkie³ku podstawowym, który po wy-

Tabela III: Aktywnoœæ hydrolityczna izolowanych szczepów w zale¿noœci od ich aktywnoœci lipolitycznej i proteolitycznej. Czêœæ I

Table III: Hydrolytic activity of isolates depending on their lipolytic and proteolytic activity. Part I

Numer enzymu

Number of enzyme

AktywnoϾ

I

II

III

IV

V

VI

VII

VIII

IX

X

enzymatyczna

w skali punktowej

Enzymatic activity

in score scale

Grupa I – Szczepy o aktywnoœci lipolitycznej

Group I – Strains with lipolytic activity

Wartoœci œrednie

0,43

1,14

1,57

1,86

2,0

0,86

0,71

0,57

0

0,29

Mean values

±

±

±

±

±

±

±

±

±

0,14

0,2

0,14

0,1

0,55

0,1

0,1

0,1

0,1

Grupa II – Szczepy o aktywnoœci proteolitycznej

Group II – Strains with proteolytic activity

Wartoœci œrednie

2,09*

3,55*

3,91**

1,45***

3,64

1,45***

0,41

0****

0

3,00*

Mean values

±

±

±

±

±

±

±

±

0,14

0,24

0,21

0,19

0,23

0,19

0,21

0,21

Grupa III – szczepy o aktywnoœci lipolitycznej i proteolitycznej

Group III – Strains with lipolytic and proteolytic activity

Wartoœci œrednie

1,73

•

3,1

••

3,22

1,32

•••

3,92

1,76

1,19

0,14

0,05

2,43

••••

Mean values

±

±

±

±

±

±

±

±

±

±

0,17

0,2

0,19

0,1

0,18

0,14

0,16

0,06

0,04

0,2

*p=0,001, **p=0,03,***p<0,05, ****p=0,007 grupa I vs grupa II / group I vs group II

p=0,001, p<0,01, p=0,003 grupa II vs grupa III / group II vs group III

•

p=0,01,

••

p=0,005,

•••

p=0,002,

••••

p<0,001 grupa I vs grupa III / group I vs group III test Wilcoxona (Wilcoxon’s test)

Tabela IV: Aktywnoœæ hydrolityczna izolowanych szczepów w zale¿noœci od ich aktywnoœci lipolitycznej i proteolitycznej. Czêœæ II

Table IV: Hydrolytic activity of isolates depending on their lipolytic and proteolytic activity. Part II

Numer enzymu

Number of enzyme

AktywnoϾ

XI

XII

XIII

XIV

XV

XVI

XVII

XVIII

XIX

enzymatyczna

w skali punktowej

Enzymatic activity

in score scale

Grupa I – Szczepy o aktywnoœci lipolitycznej

Group I – Strains with lipolytic activity

Wartoœci œrednie

0,57*****

0,57

0,57*****

0,29*****

0,57******

0

0

0

0

Mean values

±

±

±

±

±

0,14

0,14

0,14

0,1

0,25

Grupa II – Szczepy o aktywnoœci proteolitycznej

Group II – Strains with proteolytic activity

Wartoœci œrednie

2,09

0

0,64

0

2,1

0,45

1,18

0

0

Mean values

±

±

±

±

±

0,21

0,2

0,35

0,14

0,25

Grupa III – szczepy o aktywnoœci lipolitycznej i proteolitycznej

Group III – Strains with lipolytic and proteolytic activity

Wartoœci œrednie

1,43

0,08

•

0,1

0,11

1,22

0

0,43

0

0

Mean values

±

±

±

±

±

±

0,2

0,05

0,05

0,05

0,23

0,1

*****p=0,01, ******p=0,005 grupa I vs grupa II / group I vs group II

p=0,007, p<0,01, p=0,07, p=0,001 grupa II vs grupa III / group II vs group III

•p=0,01 grupa I vs grupa III / group I vs group III test Wilcoxona (Wilcoxon’s test)

19

Parametry wirulencji szczepów Candida albicans izolowanych z ontocenozy pochwy pacjentek z kandydoz¹

suszeniu utrwalano przez 45 min

w 70% roztworze alkoholu etylo-

wego i barwiono fioletem krysta-

licznym przez 30 s. Preparaty

ogl¹dano pod mikroskopem œwie-

tlnym przy powiêkszeniu 1000×

pod imersj¹. Dla ka¿dego szcze-

pu liczono liczbê komórek dro¿-

d¿aków przylegaj¹cych do 50

losowo wybranych komórek na-

b³onka i okreœlano œredni¹ liczbê

komórek dro¿d¿aków przylegaj¹-

cych do jednej komórki nab³onka.

Ocenê wra¿liwoœci na pow-

szechnie stosowane antymiko-

tyki prowadzono metod¹ dyfu-

zyjno-kr¹¿kow¹. Dokonywano

tego na pod³o¿u YNB o sk³a-

dzie: Yeast Nitrogen Base-Difco

0,5%, glukoza 3%, agar 1,8%,

pH 7, sterylizowanym 15 min

w 1,5 atm. Pod³o¿e rozlewano

po 15 ml na p³ytki Petriego œred-

nicy 9 cm. Do oznaczania wra¿-

liwoœci u¿yto ja³owych, wysyco-

nych lekami kr¹¿ków bibu³owych

Whatman 3 MMChr œrednicy

6 mm, produkowanych przez Dom

Handlowy Nauki Sp. z o.o. PAN

w Krakowie. Zawiesinê do ba-

dania wra¿liwoœci uzyskiwano

z czystych 24-godzinnych hodo-

wli na pod³o¿u Sabourauda 625

szczepów grzybów dro¿d¿opo-

dobnych izolowanych od pacjen-

tek, rozprowadzaj¹c „oczko” ezy

œrednicy 2 mm, p³asko wype³nio-

ne w 5 ml p³ynu fizjologicznego.

Zawiesinê równomiernie rozle-

wano po powierzchni pod³o¿a

YNB, nadmiar usuwano, a p³ytkê lekko uchylon¹ pozo-

stawiano w temperaturze pokojowej, aby osuszyæ po-

wierzchniê pod³o¿a. Na powierzchniê posianego pod-

³o¿a nak³adano kr¹¿ki bibu³owe, a nastêpnie po od-

wróceniu p³ytki do góry dnem inkubowano w temperatu-

rze 37°C. Poszczególne kr¹¿-ki zawiera³y 100 j Nystaty-

ny, 10 µg Pimarycyny, 10 µg Amfoterycyny B, 0,5 µg

5-Fluorocytozyny, 10 µg Klotrimazolu, 10 µg Mikona-

zolu, 10 µg Ketokonazolu, 10 µg Tiokonazolu i 10 µg

Flukonazolu. Strefy zahamowania wzrostu odczytywano

po 24 godzinach inkubacji. Oznaczenie stopnia wra¿li-

woœci w oparciu o œrednicê zahamowania wzrostu bada-

nego szczepu dokonywano wed³ug skali przedstawionej

w tabeli VI.

Analizê statystyczn¹ przeprowadzono przy u¿yciu

testu t-Studenta i testu Wilcoxona wykorzystuj¹c pro-

gram komputerowy Statistica 5,0.

Ze 112 izolatów Candida albicans, wyhodowanych

z ontocenozy pochwy pacjentek z przewlek³¹ nawroto-

w¹ kandydoz¹, wyodrêbniono trzy grupy szczepów.

I grupê stanowi³o 14 szczepów wykazuj¹cych wy³¹cz-

nie aktywnoœæ lipolityczn¹, II grupê – 22 szczepy o ak-

tywnoœci proteolitycznej, a III grupê – 76 szczepów

o jednoczesnej aktywnoœci lipolitycznej i proteolitycz-

nej. W grupie I zakres œrednic przejaœnienia waha³ siê

od 0,9 do 1,4 cm (œrednio 1,1±0,5), w II od 0,7 do 1,4

cm (œrednio 0,99±0,04), a w III dla aktywnoœci lipoli-

tycznej od 0,5 do 2,2 cm (œrednio 1,09±0,06) i proteoli-

tycznej od 0,5 do 1,0 cm (œrednio 0,81±0,02). Szcze-

gó³owe dane przedstawia tabela I.

Badaj¹c aktywnoœæ hydrolityczn¹ stwierdzono, ¿e

izolaty I grupy wykazywa³y najwy¿sz¹ aktywnoœæ dla

lipazy, lipazy esterazowej i esterazy, najmniejsz¹ dla

b-glukuronidazy, b-galaktozydazy i fosfatazy kwa-

œnej. Nie mia³y aktywnoœci a-chymotrypsyny, b-gluko-

zydazy, N-acetylo-b-glukozyloamidazy, a-mannozydazy

i a-fukozydazy. Szczepy grupy II najwy¿sz¹ aktywnoœæ

hydrolityczn¹ wykazywa³y dla lipazy esterazowej, aryla-

midazy leucynowej i esterazy, najmniejsz¹ dla arylami-

dazy cystynowej, b-glukozydazy i b-galaktozydazy. Nie

mia³y aktywnoœci trypsyny, a-chymotrypsyny, a-galak-

tozydazy, b-glukuronidazy, a-mannozydazy i a-fukozy-

dazy. Izolaty III grupy najwy¿sz¹ aktywnoœæ hydrolitycz-

n¹ przejawia³y w odniesieniu do arylamidazy leucyno-

wej, lipazy esterazowej i esterazy, najmniejsz¹ do a-ga-

laktozydazy, a-chymotrypsyny i b-galaktozydazy. Nie

Tabela V: Œrednia liczba przyleg³ych komórek grzybów dro¿d¿opodobnych do komórek

nab³onka b³ony œluzowej policzka

Table V: Mean value of adherenced yeast-like fungi cells to human buccal epithelial

cells

Liczba przyleg³ych

Szczepy z aktywnoœci¹

Szczepy z aktywnoœci¹

Szczepy z aktywnoœci¹

komórek grzybów

lipolityczn¹ – Grupa I

proteolityczn¹ – Grupa II lipolityczno-proteolityczn¹

dro¿d¿opodobnych

Strains with

Strains with

– Grupa III

do jednej komórki

lipolytic activity –

proteolytic activity –

Strains with

nab³onka b³ony

Group I

Group II

lipolytic-proteolytic

œluzowej policzka

activity – Group III

Amount of

adherenced

yeast-like cells to

human

buccal epithelial cells

Minimalna 1

10

20

Minimal

Maksymalna 115

113

120

Maximal

Œrednia

25,06* ±1,04

39,16* ±1,54

48,26* ±1,24

Mean

*p<0,001 grupa I vs grupa II, grupa I vs grupa III, grupa II vs grupa III (test t-Studenta)

*p<0.001 group I vs group II, group I vs group III, group II vs group III (t-Student’s test)

Tabela VI: Interpretacja wyników w metodzie dyfuzyjno-kr¹¿kowej oceny wra¿liwoœci

grzybów dro¿d¿opodobnych na antymikotyki

Table VI: Interpretation of results of the susceptibility to antimycotics in the disc

diffusion method

Lek Wra¿liwy

Zmniejszona

wra¿liwoœæ

Oporny

Drug

Sensitive

Intermediate

Resistant

Amfoterycyna B

³16

12-16

<12

Amphotericin B

5-Fluorocytozyna

³20

16-20

<16

5-Fluorocytosine

Nystatyna / Nystatin

³18

14-18

<14

Pimarycyna / Pimaricine

Klotrimazol / Clotrimazole

Mikonazol / Miconazole

Ketokonazol / Ketoconazole

Tiokonazol / Tioconazole

Flukonazol / Fluconazole

El¿bieta Krajewska-Ku³ak, Wiaczes³aw Niczyporuk

Mikol. Lek. 1998, 5 (1)

wykazywa³y aktywnoœci dla b-glukozydazy, a-mannozy-

dazy i a-fukozydazy. Szczegó³owe dane przedstawiaj¹

tabele III i IV.

Stwierdzono istotne statystycznie ró¿nice w ak-

tywnoœci pomiêdzy poszczególnymi enzymami w za-

le¿noœci od aktywnoœci lipolitycznej, proteolitycznej

lub lipolityczno-proteolitycznej. Szczegó³owe dane

przedstawiaj¹ tabele III i IV.

W ocenie adherencji wyizolowanych szczepów Can-

dida albicans do nab³onka b³ony œluzowej policzka

stwierdzono, ¿e szczepy grupy I (o aktywnoœci lipoli-

tycznej) charakteryzowa³y siê przyleganiem do jednej

komórki nab³onka œrednio 25,06±1,04 komórek dro¿-

d¿y, szczepy grupy II (o aktywnoœci proteolitycznej) œre-

dnio 39,16±1,54 komórek dro¿d¿y, a szczepy grupy III

(o jednoczesnej aktywnoœci lipolityczno-proteolitycznej)

œrednio 48,26±1,24 komórek dro¿d¿y.

Wykazano znamienne statystycznie ró¿nice w œre-

dniej liczbie komórek dro¿d¿y przylegaj¹cych do jed-

nej komórki nab³onka w zale¿noœci od aktywnoœci lipo-

Tabela VII: Ocena opornoœci na antymikotyki w zale¿noœci od aktywnoœci enzymatycznej

Table VII: Assessment of resistance to antimycotics in dependence on the enzymatic activity

Gatunek Nystatyna

Pimarycyna Amfoterycyna

5-Fluorocytozyna

Klotrimazol

Mikonazol

Ketokonazol

Tiokonazol

Flukonazol

Species

Nystain

Pimaricine

Amphotericin

5-Fluorocytosine Clotrimazole Miconazole

W ZW O

W ZW O

W ZW O

W ZW O

W ZW O

W ZW O

S

I

R

S

I

R

S

I

R

S

I

R

S I

R

S

I

R

Grupa I – Szczepy o aktywnoœci lipolitycznej

Group I – Strains with lipolytic activity

n=14

6

4

4

10 1

3

10 4

–

14 –

–

14 –

–

14 –

–

OpornoϾ 28,6%

21,4%

0

0

0

0

Resistance

Opornoœæ Ogó³em

6,3%

Resistance Total

Grupa II – Szczepy o aktywnoœci proteolitycznej

Group II – Strains with proteolytic activity

n=22

8 10 4

– 2 20

14 8

–

18 –

4

16 6

–

16 1

5

OpornoϾ 18,2%*

90,9%**

0

18,2%***

0

22,7%****

Resistance

Opornoœæ Ogó³em

22,2%

Resistance Total

Grupa III – Szczepy o aktywnoœci lipolitycznej i proteolitycznej

Group III – Strains with lipolytic and proteolytic activity

n=76

2 18 56

6 2 68

10 26 40

70 6

–

55 17 4

50 12 14

Opornoœæ 73,3%•

89,5%°

52,6%•°°

0

5,3%°°°

18,4%°°

Resistance

Opornoœæ Ogó³em

34,4%•*****

Resistance Total

*p=0,008, **p=0,03, ***p=0,006, ****p=0,002, *****p=0,001 grupa I vs grupa II / group I vs group II

•p<0,001 grupa II vs grupa III / group II vs group III

°p=0,005, °°p<0,001, °°°p<0,05 grupa I vs grupa III / group I vs group III test Wilcoxona (Wilcoxon’s test)

W ZW O

W ZW O

W ZW O

S I R

S I R

S I R

14 – –

14 – –

12 1 1

0

0

7,1%

16 4 2

18 1 3

12 4 6

9,1%

13,6%

27,3%

52 4 20

70 2 4

41 6 29

26,3%°°

5,3%•°°°

38,2%•°°

Tabela VIII: Opornoœæ badanych szczepów Candida albicans na dwa i wiêcej leków

Table VIII: Resistance of tested Candida albicans strains to 2 or more drugs

Odsetek szczepów opornych

Percentage of resistant strains

Liczba szczepów

2 i wiêcej leków

2 leki

3 leki

4 leki

5 leków

6 leków

7 leków

8 leków

Number of strains

2&more drugs

2 drugs

3 drugs

4 drugs

5 drugs

6 drugs

7 drugs

8 drugs

Grupa I – Szczepy o aktywnoœci lipolitycznej

Group I – Strains with lipolytic activity

n=14

4 (28,6%)

4 (28,6%)

–

–

–

–

–

–

Grupa II – Szczepy o aktywnoœci proteolitycznej

Group II – Strains with proteolytic activity

n=22

13* (59,1%)

9 (40,9%)

–

4 (18,2%)

–

–

–

–

Grupa III – Szczepy o aktywnoœci lipolitycznej i proteolitycznej

Group III – Strains with lipolytic and proteolytic activity

n=76

58•° (76,3%)

19 (25%)

17 (65,4%)

3 (3,9%)

7 (9,2%)

12 (15,8%)

–

–

*p=0,008 grupa I vs grupa II / group I vs group II

•p=0,008 grupa II vs grupa III / group II vs group III

°p=0,05 grupa I vs grupa III / group I vs group III test Wilcoxona (Wilcoxon’s test)

Ketoconazole Tioconazole Fluconazole

20

21

Parametry wirulencji szczepów Candida albicans izolowanych z ontocenozy pochwy pacjentek z kandydoz¹

litycznej, proteolitycznej lub lipolityczno-proteolitycz-

nej. Szczegó³owe dane przedstawia tabela V.

Badaj¹c wra¿liwoœæ na powszechnie stosowane

antymikotyki zaobserwowano, ¿e szczepy grupy I gene-

ralnie by³y oporne na wszystkie leki w 6,3%, szczepy

grupy II w 22,2%, a szczepy grupy III w 34,4%.

Izolaty I grupy nie wykazywa³y opornoœci na 6 z 9

badanych leków: amfoterycynê, 5-fluorocytozynê, klo-

trimazol, mikonazol, ketokonazol i tiokonazol. Szczepy

grupy II najbardziej by³y oporne na pimarycynê (90,9%),

a nie mia³y opornoœci na amfoterycynê i klotrimazol.

Izolaty grupy III przejawia³y najwiêksz¹ opornoœæ na

pimarycynê (89,5%), nystatynê (73,7%) i nie przeja-

wia³y opornoœci jedynie na 5-fluorocytozynê. Szcze-

gó³owe dane przedstawia tabela VII. Interesuj¹ce jest,

¿e szczepy o jednoczesnej aktywnoœci lipolityczno-pro-

teolitycznej w 73,6% by³y oporne na dwa i wiêcej oce-

nianych leków, w tym g³ównie na trzy leki. Szczepy

o aktywnoœci lipolitycznej wykazywa³y opornoœæ na

dwa i wiêcej leków w 28,6%, a o aktywnoœci proteoli-

tycznej w 59,1%. Stwierdzono znamienne statystycznie

ró¿nice w opornoœci na badane antymikotyki w zale¿-

noœci od aktywnoœci lipolitycznej, proteolitycznej lub li-

polityczno-proteolitycznej. Szczegó³owe dane przed-

stawiaj¹ tabele VII i VIII.

Omówienie

W literaturze od dawna znany jest fakt, ¿e aktyw-

noϾ lipolityczna, a przede wszystkim proteolityczna,

mog¹ byæ uznawane za wskaŸnik inwazyjnoœci. Szar-

mach i wsp. wykazali, ¿e grzyby posiadaj¹ce jedno-

czeœnie w³aœciwoœci lipolityczne i proteolityczne s¹

najczêœciej przyczyn¹ dolegliwoœci ze strony uk³adu

moczowo-p³ciowego (29-31). Krzemiñska-Jaœkowiak

stwierdzi³a u pacjentek z kandydoz¹ objawow¹ zna-

miennie statystycznie wiêksz¹ liczbê szczepów Candi-

da albicans (96,6%) maj¹cych aktywnoœæ lipolityczn¹

i proteolityczn¹, w porównaniu z izolatami od pacjentek

bezobjawowych (12, 13). Wyniki naszych badañ tak¿e

wykazuj¹ wysoki odsetek szczepów – izolowanych od

pacjentek z przewlek³¹ kandydoz¹ pochwy – o jedno-

czesnej aktywnoœci lipolitycznej i proteolitycznej (69,7%).

Obecnie wiadomo, ¿e zaka¿enie grzybami rodzaju

Candida mo¿e doprowadziæ do pe³noobjawowej grzybicy

jedynie wtedy, gdy wykazuj¹ one wystarczaj¹co wysok¹

zdolnoœæ przylegania do komórek nab³onka gospodarza.

Adhezja grzybów Candida, przede wszystkim Candida

albicans, w du¿ej mierze zale¿y od przejœcia grzybów

z formy dro¿d¿owej do mycelialnej. Wykazano, ¿e ga-

tunki i szczepy posiadaj¹ce znamiennie silniejsz¹ adhe-

zjê do komórek nab³onka gospodarza, charakteryzuj¹

siê wiêksz¹ patogennoœci¹ (6, 14-16, 18-22).

W piœmiennictwie znajduje siê wiele doniesieñ do-

tycz¹cych opornoœci i obni¿onej wra¿liwoœci grzybów

na powszechnie stosowane leki przeciwgrzybicze,

która mo¿e byæ przyczyn¹ niepowodzenia w leczeniu

kandydozy (1-4, 8-13, 17, 24-26).

Uzyskane przez nas wyniki wskazuj¹, ¿e te szczepy,

które charakteryzowa³y siê aktywnoœci¹ enzymatyczn¹

lipolityczno-proteolityczn¹, przejawia³y jednoczeœnie

wy¿sz¹ aktywnoœæ hydrolityczn¹, wiêksz¹ zdolnoœæ ad-

hezji do nab³onka b³ony œluzowej policzka oraz wysok¹

opornoœæ na antymikotyki. Potwierdzaj¹ to zacytowane

wczeœniej doniesienia innych autorów wskazuj¹ce, ¿e

w³aœciwoœci enzymatyczne, zdolnoœæ do adhezji oraz

wzmo¿ona opornoœæ na antymikotyki s¹ odpowiedzial-

ne za wirulencjê grzybów i mog¹ byæ przyczyn¹ nawra-

cania kandydozy pochwy.

Wnioski

1. Szczepy Candida albicans izolowane od pa-

cjentek z przewlek³¹ nawrotow¹ kandydoz¹ pochwy

charakteryzuj¹ siê w wiêkszoœci aktywnoœci¹ lipoli-

tyczno-proteolityczn¹.

2. Izolaty o jednoczesnej aktywnoœci lipolityczno-

-proteolitycznej charakteryzowa³y siê znamiennie sta-

tystycznie wiêksz¹ aktywnoœci¹ hydrolityczn¹, wy¿sz¹

zdolnoœci¹ adhezji do nab³onka b³ony œluzowej policz-

ka oraz wiêksz¹ opornoœci¹ na badane antymikotyki.

3. W³aœciwoœci enzymatyczne, zdolnoœæ do adhe-

zji oraz wzmo¿ona opornoœæ na antymikotyki szcze-

pów izolowanych od pacjentek z nawrotow¹ kandy-

doz¹ pochwy mog¹ byæ odpowiedzialne za wirulen-

cjê grzybów i byæ przyczyn¹ nawracania objawów

kandydozy pochwy.

Piœmiennictwo

1. Arias A., Arevalo M.P., Andreu A., Rodriguez C., Sierra A.:

In vitro susceptibility of 545 isolates of Candida spp. to

four antifungal agents. Mycoses, 1994, 37, 285-289.

2. Baran E., Ruczkowska J., Dolna I., Chomontowicz M.,

£awicka I.: Wra¿liwoœæ na antymikotyki dro¿d¿aków

z rodzaju Candida izolowanych z ró¿nych materia³ów

i Ÿróde³. Przegl. Dermatol., 1992, 79, 330-335.

3. Budak A., Pawlik B., Macura A., Laskownicka Z.: Oce-

na wra¿liwoœci grzybów rodzaju Candida na klotrimazol

i mikonazol. Med. Doœw. Mikrobiol., 1978, 30, 123-127.

4. Casals J.B.: Tablet sensitivity testing of pathogenic fun-

gi. J. Clin. Pathol., 1979, 32, 719-722.

5. Friedrich E.G.: Vaginitis. Am. J. Obstet. Gynecol., 1985,

152, 247-251.

6. Ghannoum M.N., Abu-Elteen K.H.: Pathogenicity deter-

minants of Candida. Mycoses, 1990, 33, 265-282.

7. Hill L.V.H., Embil J.A.: Vaginitis: current microbiologic and

clinical concepts. Can. Med. Assoc. J., 1986, 143, 321-330.

8. Krajewska-Ku³ak E., Niczyporuk W., Januszko T.,

Czapska D., Winter W.: Ocena wra¿liwoœci na antymi-

kotyki grzybów dro¿d¿opodobnych z gatunku Candida

izolowanych od pacjentów z chorob¹ nowotworow¹.

Mikol. Lek., 1995, 2, 151-156.

9. Krajewska-Ku³ak E., Niczyporuk W., Czapska D., Ser-

win A., Z³otkowski W.: Disk-diffusion method for deter-

mining the susceptibility of the yeast-like fungi strains

to antimycotics isolated from patients with oral candi-

diasis. Med. Sci. Monit., 1995, 1, 507-511.

10. Krajewska-Ku³ak E., Niczyporuk W., Z³otkowski W.,

Winter W., Czapska D.: Ocena in vitro wra¿liwoœci

szczepów grzybów dro¿d¿opodobnych izolowanych

z pochwy na powszechnie stosowane antymikotyki.

Przegl. Dermatol., 1996, 83, 317-323.

11. Krajewska-Ku³ak E., Niczyporuk W., Januszko T.: Ba-

dania in vitro wra¿liwoœci na antymikotyki grzybów

dro¿d¿opodobnych izolowanych z ró¿nych okolic cia³a.

Przegl. Dermatol., 1997, 84, 189-196.

22

El¿bieta Krajewska-Ku³ak, Wiaczes³aw Niczyporuk

Mikol. Lek. 1998, 5 (1)

12. Krzemiñska-Jaœkowiak E., Cybulski Z., Pietkiewicz K.:

Charakterystyka szczepów Candida spp. izolowanych

z ró¿nych materia³ów klinicznych w latach 1989-1993.

Przegl. Epidemiol., 1995, 49, 305-311.

13. Krzemiñska-Jaœkowiak E., Pietkiewicz K., Ozdowska B.:

Wykorzystanie enzymatycznej aktywnoœci szczepów

z rodzaju Candida izolowanych z pochwy do ich typo-

wania i oceny chorobotwórczoœci. Med. Doœw. Mikro-

biol., 1994, 46, 225-231.

14. Macura A.B., Pawlik B., Wita B.: Candida adherence to

mucosal epithelial cells with regard to its pathogenicity.

Zentrolbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig., A., 1983, 254, 561-565.

15. Macura A.B.: Adherence of Candida to mucosal epithe-

lial cells. Acta Microbiol. Pol., 1985, 34, 55-58.

16. Macura A.B.: Ocena przydatnoœci testu adherencji in

vitro w badaniach nad przyleganiem dro¿d¿aków do

ró¿nych rodzajów nab³onków organizmu wy¿szego.

Diagn. Lab., 1985, 21, 302-307.

17. Macura A.B., Filip E., Pawlik B.: Badania in vitro aktyw-

noœci antybiotyków przeciwgrzybiczych wobec derma-

tofitów wyizolowanych z materia³ów klinicznych. Przegl.

Dermatol., 1994, 81, 156-160.

18. Macura A.B.: Rola przylegania w interakcji pomiêdzy

grzybem Candida a organizmem gospodarza. Post.

Dermatol., 1990, 7, 195-206.

19. Macura A.B., Pawlik B., Filip E.: Adherencja grzybów

Candida albicans do komórek b³ony œluzowej pochwy

u kobiet in vitro. Przegl. Dermatol., 1992, 79, 38-42.

20. Macura A.B.: Przyleganie grzybów z rodzaju Candida do

komórek ssaków. Post. Mikrobiol., 1993, 32, 321-336.

21. Macura A.B., Sys³o J.: Aktywnoœæ proteolityczna i zdol-

noœæ adherencji grzybów Candida albicans. Mikol.

Lek., 1994, 1, 7-10.

22. Macura A.B.: Przyleganie – jedna z determinant patogen-

noœci grzybów Candida. Mikol. Lek., 1994, 1, 73-79.

23. Pawlik B., Macura A.B.: Rola patogenetyczna grzybów

w zaka¿eniach dróg rodnych. Post. Dermatol., 1992, 9,

97-115.

24. Pekowski M., GwieŸdziñski Z., Koz³owski J.: Badania in

vitro wra¿liwoœci na nystatynê dro¿d¿aków z rodzaju

Candida. Przegl. Dermatol., 1972, 59, 365-371.

25. Perera J., Clayton Y.: Incidence, species distribution

and antifungal sensitivity pattern of vaginal yeasts in

Sri Lankan women. Mycoses, 1994, 37, 357-360.

26. Spinillo A., Nicola S., Colonna L. i wsp.: Frequency and

significance of drug resistance in vulvovaginal candi-

diasis. Gynecol. Obstet. Invest., 1994, 38, 130-133.

27. Sto¿ek K., Wójcik J., Pawlik B.: Ocena przydatnoœci

antymikogramu w leczeniu grzybic pochwy. Med. Doœw.

Mikrobiol., 1982, 3-4, 177-184.

28. Sweet R.L.: Importance of differential diagnosis in acute

vaginitis. Am. J. Obstet. Gynecol., 1985, 152, 921-923.

29. Szarmach M., Ma³yszko E., Wroñski A., Niczyporuk W.:

Ocena zjadliwoœci dro¿d¿aków izolowanych z dróg mo-

czowo-p³ciowych kobiet i mê¿czyzn w oparciu o test

skórny, w³aœciwoœci enzymatyczne. Przegl. Dermatol.,

1980, 67, 301-306.

30. Szarmach M., Ma³yszko E., Wroñski A., Niczyporuk W.:

Flora grzybów dro¿d¿opodobnych dróg moczop³cio-

wych kobiet i mê¿czyzn z uwzglêdnieniem aktywnoœci

enzymatycznej i objawów klinicznych. Przegl. Derma-

tol., 1982, 59, 47-51.

31. Szarmach M., Ma³yszko E., Wroñski A., Niczyporuk W.:

Versuch zur Bewertung der Virulenz hefeartiger Pilze

durch Bestimmung enzymatischer Eigenschaften und

mit einem Hautinfektionsmodell an der weißen Maus.

Mycosen, 1982, 25, 210-220.

Adres do korespondencji:

Klinika Dermatologii i Wenerologii AM

ul. œw. Rocha 3

15-879 Bia³ystok

Praca wp³ynê³a do Redakcji: 30 wrzeœnia 1997 r.

Zaakceptowano do druku: 1 grudnia 1997 r.