Prace oryginalne

/

Original papers

Mikol. Lek. 2003, 10 (4): 275-283

ISSN 1232-986X

Charakterystyka szczepów Candida sp. izolowanych w latach

2001-2002 od zwierz¹t

Characteristics of Candida sp. strains, isolated from animals in the period 2001-2002

Ma³gorzata Biegañska, Bo¿ena Dworecka-Kaszak

Zak³ad Wirusologii, Immunologii i Mykologii, Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydzia³ Medycyny Weterynaryjnej, SGGW wWarszawie

Cel pracy: Ocena zró¿nicowania szczepów Candida sp. izolowanych od zwierz¹t. Okreœlenie czêstoœci zaka¿eñ zwierz¹t w Polsce grzybami Candida sp.

(wstêp do badañ nad mo¿liwoœci¹ ich miêdzygatunkowej transmisji).

Materia³ i metody: Materia³ do badañ pobierano z przypadków klinicznych. By³y to: wymazy ze zmian skórnych, ran, uszu, nosa, gard³a, macicy, pop³u-

czyny z tchawicy, ka³ i mleko zwierz¹t oraz wymazy z wola, ka³ i wycinki narz¹dów wewnêtrznych ptaków. Analiz¹ statystyczn¹ objêto okres od

01.1998 do 31.12.2002. Przynale¿noœæ gatunkow¹ wyhodowanych dro¿d¿aków okreœlano metod¹ rutynow¹ oraz testami: filamentacji i paskowymi

API Candida i ID 32C (bioMérieux). Do oceny zró¿nicowania szczepów Candida sp. pos³u¿y³y badania lekoopornoœci i aktywnoœci hydrolaz zewn¹trz-

komórkowych w testach ATB Fungus (bioMérieux) i API ZYM (bioMérieux).

Wyniki: Wykazano systematyczny wzrost liczby zaka¿eñ zwierz¹t grzybami Candida sp. w ci¹gu ostatnich 5 lat. £¹cznie Candida sp. wykryto w 230

przypadkach, w tym: u psów – 97, koni – 51 oraz ptaków – 26, a zaka¿enia dotyczy³y g³ównie uk³adu oddechowego, uk³adu rozrodczego, skóry i jej

wytworów, a tak¿e ran. Najczêœciej by³y to zaka¿enia mieszane bakteryjno-grzybicze. W wielu przypadkach dro¿d¿akom tym towarzyszy³y inne grzyby

plechowe (Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Cladosporium) lub jednokomórkowe (Rhodothorula sp., Malassezia pachydermatis, Geotrichum candi-

dum). Do dalszych badañ zakwalifikowano 34 szczepy Candida sp. (gromadzone od 10.2001). Badania ich lekoopornoœci wykaza³y odpowiednio:

96,7% i 93,3% szczepów wra¿liwych na 5-fluorocytozynê i amfoterycynê B (MIC: 0,25-0,5 mg/l i 1 mg/l) oraz 13,3% i 10% opornych na mikonazol

i nystatynê. Badane szczepy podzielono na podstawie w³aœciwoœci biochemicznych oraz zdolnoœci filamentacji na grupy Candida albicans, Candida

non-albicans i Candida sp. Badania testem API ZYM nie pozwoli³y na znalezienie korelacji miêdzy badanymi grupami, ani te¿ profilu enzymatycznego

charakterystycznego dla szczepów z okreœlonej grupy. Porównanie aktywnoœci enzymatycznej Candida sp., pochodz¹cych od ró¿nych gospodarzy, wy-

kaza³o najwiêksze wydzielanie fosfatazy zasadowej, arylamidazy leucynowej i b-glukozydazy przez szczepy pobrane od koni. Mniejsz¹ aktywnoœæ ww.

enzymów mia³y izolaty pochodz¹ce od psów, a najmniejsz¹ ptasie. Odwrotn¹ tendencj¹ odznacza³o siê wydzielanie N-acetylo-b-glukozaminidazy.

Wnioski: Candida sp. stanowi istotny czynnik etiologiczny zaka¿eñ grzybiczych uzwierz¹t. W ostatnich 5 latach zaobserwowano znaczny wzrost liczby

zaka¿eñ grzybami z rodzaju Candida uzwierz¹t. Najczêœciej izolowano Candida sp. od psów, koni i ptaków, a wiêc zwierz¹t i ptaków towarzysz¹cych

cz³owiekowi lub gospodarskich. Mo¿e to sugerowaæ potencjaln¹ mo¿liwoœæ miêdzygatunkowej transmisji zaka¿eñ tymi dro¿d¿akami. Nie stwierdzono

istotnych ró¿nic w lekowra¿liwoœci badanych szczepów zwierzêcych w porównaniu z danymi literaturowymi, dotycz¹cymi szczepów ludzkich. Badanie

aktywnoœci hydrolaz zewn¹trzkomórkowych testem API ZYM nie pozwala na ró¿nicowanie szczepów pod wzglêdem ich przynale¿noœci do grup Candida

albicans, Candida sp. i Candida-non albicans, czy pochodzenia z ró¿nych miejsc organizmu.

S³owa kluczowe: Candida, zwierzêta, aktywnoœæ enzymatyczna, lekowra¿liwoœæ, transmisja miêdzygatunkowa

Aims of work: 1. Estimation of diversity of Candida sp. strains isolated from animals. 2. Determining the frequency of Candida sp. Isolation from

various animal species to start the experiments on establishing the possibility of transmission of thios fugi between different hosts.

Materials and methods: Materials to investigations were received from clinical samples eg.: swabs from skin disorders, wounds, ears, nose, throat, uterus,

aspirates from trachea, faeces and milk of animals and swabs from crops, faeces and internal organs of birds. Statistical analysis embraced the period

from 01.1998 to 31.12.2002. Classification of strains was done by routine method accompanied with germination tests and API Candida and ID

32C microtests (bioMérieux). To estimate the strain diversity antifungal susceptibility testing by ATB Fungus (bioMérieux) was performed and activity

of extracellular hydrolases by API ZYM microtests (bioMérieux) was checked.

275

Streszczenie

Abstract

276

Ma³gorzata Biegañska, Bo¿ena Dworecka-Kaszak

Mikol. Lek. 2003, 10 (4)

Wstêp

Zaka¿enia grzybami dro¿d¿opodobnymi z rodzaju Can-

dida oraz schorzenia przez nie wywo³ywane stanowi¹ istot-

ny problem medyczny u ludzi i to nie tylko u pacjentów

z odpornoœci¹ obni¿on¹ na skutek przebytych lub trwaj¹-

cych chorób (1-3). Wystêpowanie tych dro¿d¿aków stwier-

dza siê tak¿e u osób z prawid³owo funkcjonuj¹cym uk³a-

dem immunologicznym (4). Przeprowadzono wiele badañ

i opublikowano ich wyniki dotycz¹ce wystêpowania Candi-

da sp. w ró¿nych ontocenozach (5, 6). Ogromna wiêk-

szoœæ piœmiennictwa dotyczy szczepów izolowanych od lu-

dzi. Uogólnione lub wieloogniskowe zaka¿enia grzybami

Candida s¹ najczêœciej wynikiem endogennej reaktywacji,

ale wydaje siê, ¿e zaka¿enia egzogenne tak¿e nie nale¿¹

do rzadkoœci. W tej sytuacji istotne staje siê okreœlenie

Ÿród³a infekcji. Wœród prac dotycz¹cych zwierz¹t najczê-

œciej prezentowane s¹ takie, w których zastosowano zwie-

rzêta jako model doœwiadczalny (7, 8). Niekiedy mo¿na

znaleŸæ tak¿e opisy klinicznych przypadków kandydozy

u ptaków, np. Agapornis fischeri i Melopsittacus undula-

tus (9), i zwierz¹t egzotycznych, np. ró¿nych gatunków fok

(10). Znaczny odsetek tych doniesieñ dotyczy zwierz¹t

i ptaków trzymanych w niewoli (11). Wœród publikacji doty-

cz¹cych zwierz¹t gospodarskich dominuj¹ te opisuj¹ce

przypadki mastitis u krów, wywo³ane przez grzyby dro¿d¿o-

podobne (12, 13). Doœæ liczne s¹ doniesienia o grzybi-

cach uk³adu rozrodczego koni (14) i byd³a (15, 16), spo-

wodowanych przez Candida sp., prowadz¹ce wielokrotnie

do poronieñ. Znane s¹ tak¿e przypadki ciê¿kich zaka¿eñ

dro¿d¿akami z rodzaju Candida u zwierz¹t towarzysz¹cych

cz³owiekowi, np. psów i kotów (17-20).

Wydaje siê wiêc, ¿e wystêpowanie grzybów z rodzaju

Candida wœród zwierz¹t nale¿¹cych do ró¿nych gatunków

i schorzenia powodowane przez te dro¿d¿aki s¹ doœæ po-

wszechne. Z opublikowanych dot¹d badañ nie wynika, czy

potencjalnie istnieje mo¿liwoœæ miêdzygatunkowej transmisji

zaka¿eñ Candida sp. i jaka jest swoistoœæ biotypów po-

szczególnych gatunków tych dro¿d¿aków w stosunku do

gospodarza. Dlatego te¿ podjêto próbê okreœlenia istotno-

œci problemu zaka¿eñ tymi grzybami u zwierz¹t w Polsce, ja-

ko wstêpu do ewentualnych badañ nad mo¿liwoœci¹ ich

miêdzygatunkowej transmisji. Niniejsza praca zawiera wstêp-

ne wyniki doœwiadczeñ zwi¹zanych z ocen¹ zró¿nicowania

szczepów Candida sp. izolowanych od zwierz¹t.

Materia³ i metody

W celu okreœlenia istotnoœci problemu zaka¿eñ Can-

dida sp. u zwierz¹t przeprowadzono retrospektywn¹ ana-

lizê danych statystycznych i obliczono czêstoœæ izolacji

tych dro¿d¿aków w badaniach wykonanych w us³ugowej

pracowni diagnostycznej Katedry Nauk Przedklinicznych,

Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW w latach 1998-

-2002 z uwzglêdnieniem:

a) okolicy cia³a, z której pobrano wymaz,

b) gatunku gospodarza,

c) towarzysz¹cych drobnoustrojów,

d) ujemnych wyników badañ mikologicznych,

e) ca³kowitej liczby badañ.

W paŸdzierniku 2001 r. rozpoczêto tworzenie kolekcji

izolatów Candida sp. na bazie materia³ów klinicznych do-

starczonych do ww. pracowni diagnostycznej. Materia³

do badañ stanowi³y wymazy ze zmian skórnych, ran, uszu,

nosa, gard³a, macicy, a tak¿e pop³uczyny z tchawicy, ka³

i mleko – pochodz¹ce od zwierz¹t, oraz wymazy z wola,

ka³ i wycinki narz¹dów wewnêtrznych ptaków. Dla porów-

nania badano tak¿e w 4 przypadkach wymazy pobrane

z garde³ i uszu ludzi.

Przynale¿noœæ gatunkow¹ wyhodowanych grzybów

dro¿d¿opodobnych okreœlano na podstawie:

– badania mikroskopowego,

– morfologii kolonii na pod³o¿u Sabourauda (bioMérieux),

– testu filamentacji z surowic¹ cielêc¹,

– testów paskowych API Candida i ID 32C (bioMérieux), wy-

konywanych wg zaleceñ producenta.

Results: Data obtained from Laboratory Investigation Register from our Microbiological Laboratory (Dept. of Preclinical Sciences) have shown, that dimorphic

fungi from Candida genus are very often aethiological agents of skin and systemic diseases in animals (230 cases). The frequency of isolation have been

increasing for five following years (1998-2002) and have reached 15% of mycological positive results. Most often candidiasis was discovered in dogs,

horses and birds (chicken, pigeons). Isolation of these fungi was usually accompanied by isolation of other pathogens such as: G(+) or G(-) bacteria or

fungi (Rhodothorula sp., Malassezia pachydermatis, Geotrichum candidum). Also molds such as Aspergillus, Penicilium, Alternaria and Cladosporium

were found. Respiratory tract, urogenital tract, ear canals and skin swabs were the most frequent source of these fungi. Candida sp. were also found in

wounds. We have chosen 34 Candida sp. isolates for further experiments, collected since X. 2001 and divided into three groups (C. albicans, C. non-albi-

cans or Candida sp.) according to their biochemical and biological properties. Antifungal susceptibilty testing, have revealed high percentage of strains

susceptible for 5-fluorocytozine and amfotericine B (96.7% and 93.3%, MIC values 0.25-0,5 mg/l and 1 mg/l respectively). 13% of tested strains were

resistant to mikonazole and 10% to nystatin. Determining of extracellular hydrolases activity were applied for differentiation of the strains. Obtained

results, despite the differences we have noted, have not revealed any correlation between tested groups (C. albicans, C. non-albicans or Candida spp.)

and hydrolases activity of strains. On this stage of experiments we haven’t been able to find enzymatic profile for any of these groups. Comparison of

enzymatic activity of Candida sp. yeast strains obtained from different hosts have revealed some differences. Isolates from horses showed the highest

activity of alcaline phosphatase, leucine arylamidase and ß-glucosidase. Lower activity of canine strains was also noted. The lowest amounts of the enzymes

mentioned above were released by birds isolates. Inverse tendency was characteristic for activity of N-acetylo-ß-glucosaminidase.

Conclusios: Candida albicans still remains one of the most frequently isolated yeasts from clinical cases in animals. We’ve confirmed the increasing

tendency of Candida sp. isolation from birds, farm animals and accompanying animals. Since we have not found significant differences between human

and amimal strains the crossspecies infection with these pathogenic yeasts can’t be excluded. Essential differences in antifungal susceptibility of investi-

gated animal Candida strains in comparison to human strains given in literature were not found.

Key words: Candida, animals, enzymatic activity, antifungal susceptibility, crosspecies transmission

277

Charakterystyka szczepów Candida sp. izolowanych w latach 2001-2002 od zwierz¹t

Do dalszych badañ zakwalifikowano 34 szczepy. Ocenê

zró¿nicowania szczepów Candida sp. przeprowadzano po-

nadto za pomoc¹:

– okreœlenia aktywnoœci hydrolaz zewn¹trzkomórkowych

w teœcie API ZYM (bioMérieux) i badania lekoopornoœci

w teœcie ATB Fungus (bioMérieux), wykonywanych wg

procedur przewidzianych przez wytwórcê.

Wyniki i omówienie

Analiza danych zebranych w Ksi¹¿ce Badañ Labora-

torium Mikrobiologicznego Katedry Nauk Przedklinicznych

wskazuje, ¿e w okresie od 01.1998 do 31.12.2002 wyizo-

lowano Candida sp. w 230 przypadkach. Czêstoœæ izola-

cji grzybów nale¿¹cych do tego rodzaju w poszczegól-

nych latach, ³¹cznie z ogóln¹ liczb¹ badañ mikologicz-

nych i liczb¹ dodatnich wyników badañ hodowlanych,

przedstawiono w tabeli I i na rycinie 1. Z danych tych wy-

nika, ¿e znacznie wzros³a liczba zaka¿eñ Candida sp.

u zwierz¹t w ci¹gu ostatnich 5 lat i w 2002 r. osi¹gnê³a

wartoœæ ponad 15% wszystkich dodatnich wyników ba-

dañ mikologicznych. Rycina 2 oraz tabela II obrazuj¹ izo-

lacjê tych dro¿d¿aków od ró¿nych gospodarzy, natomiast

tabela III przedstawia okolice cia³a, z których uzyskano

szczepy Candida sp., z uwzglêdnieniem dominuj¹cych

dla danego miejsca gatunków zwierz¹t. Powy¿sze dane

wskazuj¹, i¿ najczêœciej kandydozê wykrywano u psów –

97 przypadków, koni – 51 oraz ptaków 26 (g³ównie kur,

go³êbi). Wyhodowano tak¿e Candida sp. z 28 próbek kli-

nicznych pochodz¹cych od ludzi. Jednak¿e liczba ta nie

pozwala na wnioskowanie o czêstoœci zaka¿eñ u ludzi,

gdy¿ nasze Laboratorium jest ukierunkowane na materia³y

pochodz¹ce od zwierz¹t.

Ze wspomnianego wczeœniej Ÿród³a i okresu pocho-

dz¹ informacje zebrane w tabeli III. Dowodz¹ one, ¿e naj-

czêœciej zaka¿enia dro¿d¿akami nale¿¹cymi do rodzaju

Candida dotycz¹ uk³adu oddechowego (57 przypadków),

g³ównie nosa i gard³a, uk³adu rozrodczego (31 przypad-

ków), np. pochwy, macicy, napletka, oraz skóry i jej wytwo-

rów (19 przypadków), a tak¿e ran (15 przypadków).

Do bardziej szczegó³owych testów zakwalifikowano

34 szczepy Candida sp. Podzielono je na 3 grupy, na

podstawie oceny ich w³aœciwoœci biochemicznych bada-

nych testem ID 32C (bioMérieux) z ustaleniem gatunku

oraz wyniku testu filamentacji. S¹ to:

– grupa Candida albicans – wynik testu ID 32C (bioMé-

rieux); test filamentacji – dodatni),

– grupa Candida non-albicans (wynik ID 32C (bioMérieux)

wskazywa³ na kilka gatunków lub pozwala³ tylko na ustale-

nie przynale¿noœci do rodzaju Candida, test filamentacji –

ujemny,

– grupa Candida sp. – ustalono gatunek na podstawie

testu ID32 C (bioMérieux); test filamentacji ujemny.

Taki podzia³ izolatów zastosowano w dalszych bada-

niach.

Badania ich lekoopornoœci przeprowadzone za pomoc¹

testu ATB Fungus (bioMérieux) wskazuj¹, i¿ du¿y odsetek

szczepów uzyskanych od zwierz¹t wykazuje wra¿liwoœæ na

Tabela I: Czêstoœæ izolacji grzybów dro¿d¿opodobnych z rodzaju Candida sp. w latach 1998-2002

Table I: The frequency of isolation of Candida sp. in the period 1998-2002

Rok izolacji

Ogólna liczba badañ

Ogólna liczba

Pozytywne wyniki

Candida sp.

Isolation year

No. of

mikologicznych

mikologicznych badañ hodowlanych

microbiological tests

badañ hodowlanych

Positive results of mycological tests

No. of mycological tests

1998

3112

1317

443

33,64%

28

6,32%

1999

2531

1324

732

55,29%

42

5,74%

2000

2739

1372

520

37,90%

43

8,27%

2001

2447

1256

471

37,50%

58

12,31%

2002

1870

1118

386

34,53%

59

15,28%

Tabela II: Izolacja Candida sp. od ró¿nych gospodarzy

Table II: Isolation of Candida sp. from different hosts

Gospodarz / Host

Rok / Year

Ogó³em / Total

1998

1999

2000

2001

2002

Psy / Dogs

8

26

23

19

21

97

Konie / Horses

7

3

5

17

19

51

Ludzie / Humans

4

6

7

7

4

28

Koty / Cats

6

1

1

4

1

13

Byd³o / Cows

0

1

0

1

3

5

Ptaki / Birds

2

1

6

7

10

26

Inne / Other

2

2

3

6

1

14

Ogó³em / Total

29

40

45

61

59

234

278

Ma³gorzata Biegañska, Bo¿ena Dworecka-Kaszak

Mikol. Lek. 2003, 10 (4)

Ryc. 1. Czêstoœæ izolacji Candida sp.

Fig. 1. Frequency of Candida sp. isolation

Ryc. 2. Izolacja Candida sp. od ró¿nych gospodarzy

Fig. 2. Isolation of Candida sp. from different hosts

Ryc. 3. Odsetek wra¿liwych szczepów Candida sp.

Fig. 3. Percent of susceptible Candida sp. strains

16

%

14

12

10

8

6

4

2

0

6,32%

1998

1999

2000

2001

2002

5,74%

8,27%

15,28%

12,31%

1998

1998

30

25

20

15

10

5

0

Lata

Year

Liczba

Number

Gospodarz

Host

Psy /

Dogs

Ludzie /

Humans

Byd³o /

Cows

Inne /

Other

1999

2000

96,7%

93,8%

76,7%

66,7%

70,0%

80,0%

2000
2001
2002

2002

100%

90%
80%
70%
60%
50%
40%

30%
20%
10%

0%

5-fluorocytozyna 5-fluorocytosine

Amfoterycyna B Amphotericine B

Nystatyna

Nystatin

Mikonazol Mikonazol

Ekonazol Ekonazol

Ketokonazol Ketokonazol

Antymikotyki / Antifungals

279

Charakterystyka szczepów

Candida sp

. izolowanych w

latach 2001-2002 od zwierz¹t

Ryc. 4.

Porównanie

œredniego

wytwarzania

enzy
-

mów
przez

szczepy

Candida

zró¿nych

grup

badanych

Fig. 4.

Comparison

of

mean

values

of

enzyme

pro-

duction by different

Candida

strains

Ryc. 5.

Porównanie

œredniej

aktywnoœci

enzymów

przez

szczepy

Candida

izolowane

od

ró¿-

nych gospodarzy

Fig

. 5

. Comparison

of

mean

values

of

enzyme

production

by

Candida

strains

isolated

from different hosts

Fosfataza zasadowa / Phosphatase alcaline

Esteraza (C4) / Esterase (C4)

Lipaza esterazowa (C8) / Esterase lipase (C8)

Lipaza (C14) / Lipase (C14)

Arylamidaza leucynowa / Leucine arylamidase

Arylamidaza walinowa / Valine arylamidase

Arylamidaza cystynowa / Cystine arylamidase

Trypsyna / Tripsin

Chymotrypsyna / Chymotripsin

Fosfataza kwaœna / Phosphatase acid

Naftaleno-AS-BI-fosfohydrolaza / Naphtol-AS-BI-phophohydrolase

a-galaktozydaza /

a-galactosidase

b-galaktozydaza /

b-galactosidase

b-glukuronidaza /

b-glucuronidase

a-glukozydaza /

a-glucosidase

b-glukozydaza /

b-glucosidase

N-acetylo-b-glukozaminidaza / N-acetyl-

b-glucosaminidase

a-mannozydaza /

a-mannosidase

a-fukozydaza /

a-fucosidase

Fosfataza zasadowa / Phosphatase alcaline

Esteraza (C4) / Esterase (C4)

Lipaza esterazowa (C8) / Esterase lipase (C8)

Lipaza (C14) / Lipase (C14)

Arylamidaza leucynowa / Leucine arylamidase

Arylamidaza walinowa / Valine arylamidase

Arylamidaza cystynowa / Cystine arylamidase

Trypsyna / Tripsin

Chymotrypsyna / Chymotripsin

Fosfataza kwaœna / Phosphatase acid

Naftaleno-AS-BI-fosfohydrolaza / Naphtol-AS-BI-phophohydrolase

a-galaktozydaza /

a-galactosidase

b-galaktozydaza /

b-galactosidase

b-glukuronidaza /

b-glucuronidase

a-glukozydaza /

a-glucosidase

b-glukozydaza /

b-glucosidase

N-acetylo-b-glukozaminidaza / N-acetyl-

b-glucosaminidase

a-mannozydaza /

a-mannosidase

a-fukozydaza /

a-fucosidase

Œrednia

C. albicans

/ Mean

C. albicans

Œrednia

C. non-albicans

/ Mean

C. non-albicans

Œrednia

C. sp.

/ Mean

C. sp.

Œrednia –

ptaki

/ Mean

birds

Œrednia –

konie

/ Mean

horses

Œrednia –

psy

/ Mean

dogs

Wytwarzanie – wartoœci œrednie [nM]

Production – mean values

Wytwarzanie enzymów – wartoœci œrednie [nM]

Enzyme production – mean values

40

40

35

30

25

20

15

10

5

0

35

30

25

20

15

10

5

0

Enzym /

Enzyme

Enzym /

Enzyme

280

Ma³gorzata Biegañska, Bo¿ena Dworecka-Kaszak

Mikol. Lek. 2003, 10 (4)

wiêkszoœæ z zastosowanych antymikotyków. Najwiêksz¹

wra¿liwoœæ badanych izolatów zaobserwowano dla 5-fluoro-

cytozyny i amfoterycyny B (odpowiednio 96,7% i 93,3%

szczepów wra¿liwych). Wartoœci MIC dla pierwszego

z ww. leków waha³y siê u tych szczepów w granicach od

0,25 do 0,5 mg/l, zaœ dla drugiego – 1 mg/l. Na nystatynê

wra¿liwych by³o 76,6%, na mikonazol – 66,7%, zaœ na eko-

nazol i ketokonazol odpowiednio – 70% i 80% izolatów.

Najwiêksz¹ opornoœæ Candida sp. zaobserwowano dla mi-

konazolu i nystatyny (13,3% i 10% badanych szczepów).

Wyniki te ukazuj¹ tabele IV i V oraz rycina 3.

Jednym ze wskaŸników chorobotwórczoœci grzybów

dro¿d¿opodobnych z rodzaju Candida jest wytwarzanie

i wydzielanie hydrolaz zewn¹trzkomórkowych. Do okre-

Tabela III: Izolacja Candida sp. z ró¿nych Ÿróde³ i od ró¿nych gospodarzy w latach 1998-2002

Table III: Isolation of Candida sp. from different sites and sources in the period 1998-2002

Miejsce izolacji

Liczba izolacji ogó³em

Dominuj¹cy gospodarze

Isolation site

Total isolation number

Dominating hosts

Przewody s³uchowe zewnêtrzne / Ear canals

33

psy, koty, ludzie / dogs, cats, men

Spojówki oka / Eyes (conjunctival sac)

7

konie, psy / horses, dogs

Skóra / Skin

19

koty, psy, konie / cats, dogs, horses

Rany / Wounds

15

psy, konie, koty / dogs, horses, cats

W³osy / Hair

16

psy, koty / dogs, cats

Mleko / Milk

4

byd³o / cattle

Uk³ad oddechowy / Respiratory tract:

S=57

nos / nose

29

konie, psy / horses, dogs

gard³o / throat

25

ludzie, koty / men, cats

pop³uczyny z tchawicy; dróg oddechowych

3

konie / horses

aspirates from trachea respiratory tract

Uk³ad moczowo-p³ciowy / Urogenital tract:

S=31

mocz / urine

1

pies / dog

srom / vulva

1

pies / dog

pochwa / vagina

5

ludzie, psy / men, dogs

macica / uterus

21

psy, konie / dogs, horses

napletek / foreskin

3

konie, pies / horses, dog

Przewód pokarmowy / Alimentary tract:

S=8

jama ustna, warga / mouth, lips

2

psy, œwinka morska / dogs, guinea pig

prostnica / rectum

2

psy / dogs

odbyt / anus

2

koty / cats

gruczo³y oko³oodbytowe / perianal glands

2

psy / dogs

Ka³ / Faeces

8

ludzie, psy / men, dogs

Ptaki / Birds:

S=14

narz¹dy wewnêtrzne / internal organs

4

kury, go³êbie, gêœ, struœ, wrona

dziób / beak

1

chickens, pigeons, goose, ostrich, crow

wole / crop

6

prze³yk / oesophagus

2

worek powietrzny/ air sack

1

Tabela IV: Wra¿liwoœæ szczepów Candida sp. na antymikotyki

Table IV: Susceptibility of collected animal Candida sp. strains for antifungals

Antymikotyk

Liczba testowanych

Szczepy wra¿liwe

Szczepy s³abo wra¿liwe

Szczepy oporne

Antifungal agent

szczepów

Susceptible strains

Low susceptible strains

Resistant strains

No. of tested strains

Liczba / No.

%

Liczba / No.

%

Liczba / No.

%

5-fluorocytozyna / 5-fluorocytozine

30

29

96,7%

1

3,3%

0

0%

Amfoterycyna B / Amfotericine B

30

28

93,3%

1

3,3%

1

3,3%

Nystatyna / Nystatin

30

23

76,7%

4

13,3%

3

10,0%

Mikonazol / Mikonazole

30

20

66,7%

6

20,0%

4

13,3%

Ekonazol / Ekonazole

30

21

70,0%

8

26,7%

1

3,3%

Ketokonazol / Ketokonazole

30

24

80,0%

5

16,7%

1

3,3%

281

Charakterystyka szczepów Candida sp. izolowanych w latach 2001-2002 od zwierz¹t

œlania ich produkcji wykorzystano test API ZYM (bioMé-

rieux). Wyniki zamieszczono na rycinach 4, 5. Rycina 4

przedstawia porównanie œredniego wytwarzania poszcze-

gólnych enzymów przez izolaty nale¿¹ce do grup Candi-

da albicans, C. non-albicans i C. sp. Stwierdzono znacz-

n¹ ró¿nicê w wytwarzaniu N-acetylo-b-glukozaminidazy

(ok. 25-30 nM) miêdzy szczepami Candida albicans

a zakwalifikowanymi do pozosta³ych grup. Ponadto zano-

towano wy¿sze wydzielanie b-glukozydazy przez izolaty

C.-non albicans, ni¿ w grupach C. albicans i Candida

sp. Zaobserwowano tak¿e ró¿nice, rzêdu ok. 5 nM,

w wytwarzaniu fosfatazy zasadowej, kwaœnej i a-galakto-

zydazy miêdzy poszczególnymi grupami. Du¿y rozrzut wy-

ników, dotycz¹cy produkcji konkretnego enzymu przez

szczepy w obrêbie danej grupy, nie pozwala jednak na

znalezienie ogólnej prawid³owoœci. Wydaje siê ponadto,

i¿ wszystkie zaobserwowane ró¿nice w wytwarzaniu enzy-

mów s¹ zwi¹zane ze zmiennoœci¹ poszczególnych szcze-

pów, a nie z przynale¿noœci¹ do grup.

Rycina 5 przedstawia aktywnoœæ hydrolaz zewn¹trzko-

mórkowych w testach API ZYM przez szczepy izolowane

od przyk³adowych gatunków gospodarzy, tj. psów, koni

i ptaków. Od zwierz¹t tych najczêœciej w ostatnich 5 la-

tach izolowano dro¿d¿aki z rodzaju Candida. Zaobserwo-

wane ró¿nice w wytwarzaniu poszczególnych enzymów to

przede wszystkim wiêksze wydzielanie fosfatazy zasado-

wej, arylamidazy leucynowej i b-glukozydazy przez szcze-

py izolowane od koni ni¿ przez izolaty pochodz¹ce od

psów. U tych ostatnich wytwarzanie enzymów by³o jed-

nak wy¿sze ni¿ u szczepów ptasich. Odwrotn¹ tendencj¹

odznacza³o siê wydzielanie N-acetylo-b-glukozaminidazy

– najwiêksze by³o u ptaków, mniejsze u psów i najni¿sze

u koni. Iloœci pozosta³ych enzymów wykrytych w teœcie

nie wykazywa³y istotnych ró¿nic miêdzy gatunkami. Liczba

przebadanych szczepów nie pozwala jednak na wyci¹g-

niêcie ogólnych wniosków. Konieczne s¹ dalsze bada-

nia na wiêkszej liczbie szczepów oraz przeprowadzenie

analizy danych za pomoc¹ innych narzêdzi statystycz-

nych.

Omówienie

W okresie od stycznia 1998 do grudnia 2002 r. zaob-

serwowano znaczny wzrost czêstoœci izolacji grzybów

dro¿d¿opodobnych z rodzaju Candida. Grzyby te wyho-

dowano z ponad 15% pozytywnych badañ mikologicz-

nych. Dane te œwiadcz¹, ¿e Candida sp. jest istotnym

czynnikiem etiologicznym zaka¿eñ u zwierz¹t. Zakres ga-

tunków gospodarzy, od których izolowano ww. drobno-

ustroje, jest szeroki. Poza psami i koñmi oraz ptakami,

które najczêœciej s¹ gospodarzami dla tych dro¿d¿aków,

nale¿y tak¿e wymieniæ gatunki, które rzadziej ulegaj¹ in-

fekcjom, np.: koty i byd³o, a tak¿e zwierzêta i ptaki egzo-

tyczne, np. wê¿e, strusie australijskie, ¿ubry, tchórze,

szynszyle, œwinki morskie, ¿ó³wie i œwinki kar³owate. S¹

to wiêc zwierzêta towarzysz¹ce cz³owiekowi, b¹dŸ te¿

zwierzêta i ptaki gospodarskie.

Przegl¹d miejsc i okolic cia³a zwierz¹t, z których izolowa-

no dro¿d¿aki z rodzaju Candida wskazuje, ¿e nie ma spe-

cjalnych ró¿nic miêdzy specyfik¹ miejsc izolacji Candida

sp. od ludzi i od zwierz¹t. W literaturze znaleŸæ mo¿na dane

œwiadcz¹ce o izolacji tych grzybów zarówno z uk³adu odde-

chowego (2), jak i uk³adu rozrodczego, np. z pochwy (5)

oraz ze skóry (21). W niniejszych badaniach najczêœciej izo-

lowano dro¿d¿aki z rodzaju Candida z podobnych miejsc

(tab. III), co mo¿e równie¿ sugerowaæ ewentualn¹ predylek-

cjê zaka¿eñ uk³adowych zarówno u ludzi, jak i u zwierz¹t.

Badanie lekowra¿liwoœci drobnoustrojów jest jednym

z powszechnie przyjêtych sposobów okreœlania ich cho-

robotwóczoœci (5), który oceniano tak¿e w naszej pracy.

Do tego celu zastosowano mikrotesty ATB Fungus (bio-

Mérieux). Umo¿liwiaj¹ one zastosowanie powtarzalnych

warunków doœwiadczenia dla ka¿dego z badanych szcze-

pów. Pozwala to na unikniêcie wp³ywu pH pod³o¿a, wiel-

koœci inokulum czy te¿ wahañ stê¿eñ leków w pod³o¿u na

wyniki oznaczania lekoopornoœci szczepów (22).

Zgromadzone przez nas szczepy Candida wykaza³y

najwiêksz¹ wra¿liwoœæ na amfotetrycynê B i 5-fluorocyto-

zynê (tab. IV). Wydaje siê, ¿e podobn¹ prawid³owoœæ

Tabela V: Porównanie wra¿liwoœci szczepów z ró¿nych grup na poszczególne antymikotyki

Table V: Comparison of susceptibility of different strains group for antifungals

Antymykotyk

Szczepy Candida albicans

Szczepy Candida-non albicans

Szczepy Candida sp.

Antifungal agent

Candida albicans strains

Candida non-albicans strains

Candida sp. strains

Wra¿liwe

S³abo wra¿liwe

Oporne

Wra¿liwe

S³abo wra¿liwe

Oporne

Wra¿liwe

S³abo wra¿liwe

Oporne

Susceptible

Low susceptible

Resistant

Susceptible Low susceptible

Resistant

Susceptible

Low susceptible

Resistant

5-fluorotycozyna

100%

0%

0%

92,31%

7,69%

0%

100%

0%

0%

5-fluorocytozine

Amfoterycyna B

92,86%

0%

7,14%

100%

0%

0%

85,71%

14,28%

0%

Amfotericine B

Nystatyna

57,14%

35,71%

7,14%

84,61%

7,69%

15,38%

100%

0%

0%

Nystatin

Mikonazol

64,28%

21,43%

14,28%

69,23%

15,38%

15,38%

85,71%

14,28%

0%

Mikonazole

Ekonazol

71,43%

28,57%

0%

69,23%

23,08%

7,69%

71,43%

28,57%

0%

Econazole

Ketokonazol

50,00%

42,86%

7,14%

100%

0%

0%

100%

0%

0%

Ketokonazole

282

Ma³gorzata Biegañska, Bo¿ena Dworecka-Kaszak

Mikol. Lek. 2003, 10 (4)

mo¿na zaobserwowaæ w przypadku szczepów ludzkich,

ale liczba tych szczepów badanych przez nas jest zbyt

ma³a, aby mo¿na by³o wyci¹gn¹æ ostateczne wnioski. Po-

twierdzaj¹ to jednak pewne dane literaturowe. Durupinar

i wsp. (23) opisali lekoopornoϾ 60 szpitalnych szcze-

pów Candida. Z przebadanych przez nich szczepów

100% by³o wra¿liwe na amfoterycynê B i 5-fluorocytozy-

nê, zaœ 25% – wykaza³o opornoœæ na mikonazol. Czê-

œciowo dane te potwierdzaj¹ D¹bkowska i wsp. (22)

w swojej pracy dotycz¹cej lekowra¿liwoœci 418 szcze-

pów Candida albicans i 65 innych izolatów. W bada-

niach tych, przeprowadzonych z wykorzystaniem testu

ATB Fungus, wykazano 100%-proc. wra¿liwoœæ Candida

albicans na amfoterycynê B i nystatynê oraz 92-proc.

wra¿liwoœæ na 5-fluorocytozynê. Nie stwierdzono istot-

nych ró¿nic we wra¿liwoœci miêdzy szczepami Candida

albicans a Candida nale¿¹cymi do innych gatunków, po-

za ró¿nic¹ we wra¿liwoœci na 5-fluorocytozynê. W przy-

padku tego leku odsetek izolatów, dla których wartoœci

MIC waha³y siê w granicach 0,25-4 mg/l wynosi³ 91,9%

dla Candida albicans i 57% dla Candida sp. i innych

grzybów dro¿d¿opodobnych.

Stwierdzone podobieñstwa miêdzy grupami obejmo-

wa³y:

– wysok¹ wra¿liwoœæ wszystkich grup na 5-fluorocytozy-

nê, tj. 100% dla Candida albicans i Candida sp. oraz

92,31% dla Candida non-albicans,

– znaczn¹ wra¿liwoœæ na amfoterycynê B, tj. 92,86% dla

Candida albicans oraz 100% dla Candida non-albi-

cans i 85% u Candida sp.

Zaobserwowano tak¿e ró¿nice:

– szczepy Candida albicans wykaza³y du¿o mniejsz¹

wra¿liwoœæ na ketokonazol (50%) i nystatynê (57,14%)

ni¿ Candida sp. (100% wra¿liwych na oba œrodki) oraz

izolaty z grupy Candida non-albicans (odpowiednio

100% i 84,61%);

– szczepy nale¿¹ce do grupy Candida sp. s¹ bardziej wra¿li-

we na 5-fluorocytozynê ni¿ Candida non-albicans (100%

i 92,31% wra¿liwych). Odwrotn¹ prawid³owoœæ stwierdzo-

no dla amfoterycyny B – odpowiednio 85,71% i 100%;

– wœród Candida sp. nie wykazano w ogóle szczepów

opornych na zastosowane antymikotyki.

Wykonane przez nas testy API ZYM, nie pozwoli³y na zna-

lezienie korelacji miêdzy przynale¿noœci¹ do grupy C. albi-

cans, C. non-albicans i Candida sp. a wytwarzaniem i wy-

dzielaniem hydrolaz zewn¹trzkomórkowych. Nie ustalono tak-

¿e charakterystycznego dla grupy profilu enzymatycznego.

Porównanie œredniego wytwarzania enzymów przez

szczepy izolowane od wybranych zwierz¹t, bêd¹cych

w okresie 1998-2002 najczêstszymi gospodarzami dla

dro¿d¿aków z rodzaju Candida, nie wykaza³o istotnych

ró¿nic jakoœciowych. Zaobserwowano jedynie iloœciowe

ró¿nice w produkcji i wydzielaniu fosfatazy zasadowej,

arylamidazy leucynowej i b-glukozydazy przez szczepy

izolowane od koni, psów i ptaków. Trudno jest mimo to

wyci¹gaæ szersze wnioski, poniewa¿ liczba przebadanych

szczepów jest zbyt du¿a, a wytwarzanie danego enzymu

przez poszczególne szczepy jest zró¿nicowane. Znalezie-

nie korelacji miêdzy pochodzeniem izolatów od ró¿nych

gatunków gospodarzy a ich wzorem enzymatycznym wy-

maga dalszych badañ.

Jedyna prawid³owoœæ w wytwarzaniu enzymów, jak¹

mo¿na zaobserwowaæ, jest ogólna i dotyczy raczej wszyst-

kich szczepów z rodzaju Candida, niezale¿nie od ich przy-

nale¿noœci gatunkowej, zakwalifikowania do jednej z grup

badanych, czy te¿ izolacji z okreœlonego miejsca lub od jed-

nego gatunku. Zaobserwowano, ¿e je¿eli aktywnoœæ wytwa-

rzanego enzymu jest wysoka (20-40 nM), to jest ona podob-

na dla wszystkich grup badanych, gatunków gospodarzy

i ró¿nych miejsc izolacji. Tê sam¹ prawid³owoœæ wykazuje

niska (do 5 nM) produkcja lub jej brak. Z literatury wynika,

¿e w przypadku szczepów ludzkich wytwarzanie i wydziela-

nie hydrolaz zewn¹trzkomórkowych jest zwi¹zane ze sta-

nem klinicznym – u nosicieli Candida sp. jest ono znacznie

ni¿sze, ni¿ u osób z objawami klinicznymi (5). W przypadku

przedstawianej kolekcji wszystkie szczepy pochodz¹ z przy-

padków klinicznych. St¹d prawdopodobnie wynika brak

znamiennych ró¿nic miêdzy badanymi grupami, pozwalaj¹-

cych na klasyfikowanie szczepów na podstawie wytwarzania

enzymów.

Prezentowane powy¿ej doœwiadczenia zapocz¹tkowa³y

cykl badañ maj¹cych na celu ocenê mo¿liwoœci miêdzyga-

tunkowej transmisji grzybów dro¿d¿opodobnych z rodzaju

Candida oraz opisanie ewentualnej ró¿norodnoœci bioty-

pów jego podstawowych gatunków. Na podstawie wyko-

nanych testów nie wykazano istotnych ró¿nic miêdzy prze-

badanymi szczepami pochodz¹cymi od zwierz¹t, a szcze-

pami ludzkimi znanymi z literatury, co mo¿e sugerowaæ,

¿e istnieje potencjalna mo¿liwoœæ miêdzygatunkowej trans-

misji grzybów z rodzaju Candida. Aby jednak mo¿na by³o

potwierdziæ tê tezê, konieczne s¹ dalsze eksperymenty,

np. okreœlenie proteaz serynowych, zbadanie adherencji

badanych szczepów do komórek nab³onka ludzi i zwie-

rz¹t oraz zastosowanie technik molekularnych do ró¿nico-

wania zgromadzonych szczepów.

Wnioski

– Candida sp. stanowi istotny czynnik etiologiczny za-

ka¿eñ grzybiczych u zwierz¹t.

– W ostatnich 5 latach zaobserwowano znaczny wzrost

liczby zaka¿eñ grzybami dro¿d¿opodobnymi z rodzaju

Candida u zwierz¹t.

– Najczêœciej izolowano Candida sp. od psów, koni

i ptaków, a wiêc zwierz¹t i ptaków towarzysz¹cych cz³owie-

kowi lub gospodarskich. Mo¿e to sugerowaæ potencjaln¹

mo¿liwoœæ miêdzygatunkowej transmisji zaka¿eñ tymi dro¿-

d¿akami.

– Nie stwierdzono istotnych statystycznie ró¿nic w lekow-

ra¿liwoœci badanych szczepów zwierzêcych w porównaniu

z danymi literaturowymi, dotycz¹cymi szczepów ludzkich.

– Badanie aktywnoœci hydrolaz zewn¹trzkomórkowych

testem API ZYM nie pozwala na ró¿nicowanie szczepów

pod wzglêdem ich przynale¿noœci do grup Candida albi-

cans, Candida sp. i Candida non-albicans, czy pocho-

dzenia z ró¿nych miejsc organizmu.

Piœmiennictwo

1. Macura A.B., Bort A.: Characteristics of Candida albicans strains

isolated from oral cavity in HIV-positive patients. Mikol. Lek.,

2002, 9, 17-25.

2. Batura-Gabryel H., KuŸnar B.: Inwazje wieloogniskowe grzybami

z rodzaju Candida i kandydoza jamy ustnej u chorych na raka p³uca

(RP) i przewlek³¹ obturacyjn¹ chorobê p³uc (POChP). Mikol. Lek.,

2000, 7 (supl. 1), 66-67.

3. Niczyporuk W., Krajewska-Ku³ak E., £ukaszczuk C., Krawczuk-Ry-

bak M., Wojtukiewicz M.: Zaka¿enia grzybami dro¿d¿opodobnymi

283

Charakterystyka szczepów Candida sp. izolowanych w latach 2001-2002 od zwierz¹t

problemem pacjentów onkologicznych. Mikol. Lek., 2000, 7

(supl. 1), 68-69.

4. Majewska A., Sozañska Z., Kasiak M., Czajczyñska-Waszkiewicz A.:

Wystêpowanie grzybów dro¿d¿opodobnych w jamie ustnej a in-

tensywnoœæ próchnicy zêbów. Mikol. Lek., 2000, 7, 71-75.

5. Krajewska-Ku³ak E., Niczyporuk W.: Parametry wirulencji szcze-

pów Candida albicans izolowanych z ontocenozy pochwy pa-

cjentek z kandydoz¹. Mikol. Lek., 1998, 5, 15-22.

6. Kurnatowska A., Horwatt E.: Dzia³anie natamycyny in vitro na

szczepy Candida wyodrêbnione od pacjentów z kandydoz¹ wie-

loogniskow¹. Mikol. Lek., 1998, 5, 9-12.

7. Beninati C., Oggioni M.R., Boccanera M., Spinosa M.R., Maggi T.,

Conti S., Magliani W., DeBernardis F., Teti G., Cassone A., Pozzi

G., Polonelli L.: Therapy of mucosal candidiasis by expression of

an anti-idiotype in human commensal bacteria. Nature Biotech.,

2000, 18, 1060-1064.

8. Moragues M.D., Omaetxebarria M.J., Elguezabal N., Bikandi J.,

Quindos G., Coleman D.C., Ponton J.: Serological differentiation

of experimentally induced Candida dubliniensis and Candida al-

bicans infections. J. Clin. Microbiol., 2001, 39, 2999-3001.

9. Sato Y., Aoyagi T., Kobayashi T., Inoue J.: Occurrences of candi-

diasis in a Fisher’s lovebird and a budgerigar. J. Vet. Med. Sci.,

2001, 63, 939-941.

10. Dunn J.L., Buck J.D., Spotte S.: Candidiasis in captive pinni-

peds. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1984, 185, 1328-1330.

11. Medway W.: Some bacterial and mycotic diseases of marine

mammals. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1980, 177, 831-834.

12. Keller B., Scheibl P., Bleckmann E., Hoedemaker M.: Differentia-

tion of yeasts in mastitis milk. Mycoses, 2000, 43 (supl. 1), 17-

-19.

13. Kitamura H., Anri A., Fse K., Seo M., Itakura C.: Chronic mastitis

caused by Candida maltosa in a cow. Vet. Pathol., 1990, 27,

465-466.

14. Blue MG.: Mycotic invasion of the mare’s uterus. Vet. Rec., 1983,

113, 131-132.

15. Jensen H.E., Krogh H.V., Schonheder H.: Bovine mycotic abor-

tion – a comparative study of diagnostic methods. Zentralbl. Ve-

terinarmed. B., 1991, 38, 33-40.

16. Foley G.L., Schlafer D.H.: Candida abortion in cattle. Vet. Pathol.,

1987, 24, 532-536.

17. Forward Z.A., Legendre A.M., Khalsa H.D.: Use of intermittent

bladder infusion with clotrimazole for treatment of candiduria in

a dog. J. Am. Vet. Med. Assoc., 2002, 220, 1496-1498, 1474-

-1475.

18. Mueller R.S., Bettenay S.V., Shipstone M.: Cutaneous candidiasis

in a dog caused by Candida guilliermondii. Vet. Rec., 2002,

150, 728-730

19. Ben-Ziony Y., Arzi B.: Use of lufenuron for treating fungal infections

of dogs and cats: 297 cases (1997-1999). J. Am. Vet. Med. Assoc.,

2000, 217, 1510-1513.

20. Gerding P.A., Morton L.D., Dye J.A.: Ocular and disseminated candi-

diasis in an immunosuppressed cat. J. Am. Vet. Med. Assoc., 1994,

204, 1635-1638.

21. Mrotek M., Zegarska B., Zimna M., Budna W.: Grzyby chorobo-

twórcze w materiale Pracowni Mikologicznej Przychodni Derma-

tologicznej w Bydgoszczy w okresie styczeñ 1996-sierpieñ

2000. Mikol. Lek., 2001, 8, 153-157.

22. D¹bkowska M., Garczewska B., Dzier¿anowska D.: Lekowra¿li-

woœæ szczepów Candida oceniona testem ATB Fungus firmy bio-

Mérieux. Mikol. Lek., 1998, 5, 5-7.

23. Durupinar B., Günaydin M., Saniç A., Pirinçciler M., Leblebiciloglu

H.: In vitro susceptibility of yeast isolates from various clinical

specimens to antifungal agents. Mikol. Lek., 1996, 3, 9-12.

Praca zosta³a czêœciowo przedstawiona na Kongresie ISHAM, San Antonio,

USA, 25-29.05.2003 r.

Adres do korespondencji:

Ma³gorzata Biegañska

Zak³ad Wirusologii, Immunologii i Mykologii,

Katedra Nauk Przedklinicznych,

Wydzia³ Medycyny Weterynaryjnej, SGGW

ul. Ciszewskiego 8

Warszawa

Praca wp³ynê³a do Redakcji: 26 lipca 2003 r.

Zaakceptowano do druku: 15 wrzeœnia 2003 r.