Medycyna Wet. 2007, 63 (9)

1120

Praca oryginalna

Original paper

Produkcja ryb ³ososiowatych w Europie wynosi oko-

³o 234 068 t rocznie, zaœ w Polsce oko³o 11 000 t rocz-

nie (7). Jedn¹ z g³ównych przyczyn strat w hodowli

tych ryb s¹ choroby wirusowe, w tym, miêdzy innymi,

wirusowa posocznica krwotoczna (VHS, viral haemor-

rhagic septicaemia), zakaŸna martwica uk³adu krwio-

twórczego (IHN, infectious haematopoietic necrosis)

oraz zakaŸna anemia ³ososia (ISA, infectious salmon

anaemia), które objête s¹ wytycznymi zawartymi

w dyrektywach Unii Europejskiej (5, 6). W Polsce istot-

ny problem w hodowli pstr¹ga têczowego stanowi

VHS, gdy¿ w co pi¹tym badanym gospodarstwie pstr¹-

gowym stwierdzono wystêpowanie wirusa tej choro-

by (VHSV) (1). Do gatunków wra¿liwych na zaka¿e-

nie VHSV nale¿¹ zarówno ryby s³odkowodne (pstrag

teczowy, Oncorhynchus mykiss; pstrag potokowy,

Salmo trutta m. fario; szczupak, Esox lucius; lipien,

Thymallus thymallus), dwuœrodowiskowe (troæ,

Salmo trutta m. trutta; ³osoœ atlantycki, Salmo salar),

jak i morskie (dorsz atlantycki, Gadus morhua; dorsz

pacyficzny, Gadus macrocephalus; œledŸ pacyficzny,

Clupea pallasii; turbot, Scophthalmus maximus). Jed-

nak epizootie VHS pojawiaj¹ siê najczêœciej w hodowli

pstr¹ga têczowego, u którego œmiertelnoœæ wylêgu

i narybku zaka¿onego VHSV w temperaturze 9-12°C

siêgaæ mo¿e nawet 100%, podczas gdy u starszych ryb

wynosi 10-50% (16).

VHSV nale¿y do rodziny Rhabdoviridae, rodzaju

Novirhabdovirus (14). Jego wirion stanowi typowy dla

rodziny Rhabdoviridae kapsyd w kszta³cie pocisku

otoczony os³onk¹ z glikoproteinowymi wypustkami

oraz jednoniciowy, niesegmentowany RNA o ujem-

nej polarnoœci. W sk³ad genomu o d³ugoœci 11 158 pz

wchodzi 6 genów, z których piêæ koduje bia³ka struk-

turalne: gen N – bia³ko nukleokapsydu, gen P – fosfo-

Analiza filogenetyczna polskich szczepów

wirusa posocznicy krwotocznej ryb*

)

ALEKSANDRA RUSZCZYK, EDWARD GRAWIÑSKI*, ADA SCHOLLENBERGER,

ZUZANNA NOWAK**, MAREK NIEMIA£TOWSKI

Zak³ad Immunologii Katedry Nauk Przedklinicznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW,

ul. Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa

*Zak³ad Higieny Weterynaryjnej, ul. Kaprów 10, 80-316 Gdañsk-Oliwa

**Zak³ad Genetyki Molekularnej Katedry Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierz¹t Wydzia³u Nauk o Zwierzêtach SGGW,

ul. Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa

Ruszczyk A., Grawiñski E., Schollenberger A., Nowak Z., Niemia³towski M.

Phylogenetic analysis of Polish strains of viral hemorrhagic septicemia virus

Summary

Viral hemorrhagic septicemia (VHS) is an emerging disease posing a threat to the European rainbow trout

industry. In Poland VHS is diagnosed in every fifth rainbow trout farm. Glycoprotein encoded by gene G of

VHSV facilitates virus entrance into the cell and is an important antigen responsible for neutralizing antibody

production. Based on sequence analysis of this gene 4 major genotypes of VHSV, with many different

sub-groups, have been established. To analyze several Polish strains of VHSV we applied one step RT-PCR

and semi-nested PCR for detecting and sequencing the gene encoding variable fragment of virus glycoprotein.

We tested 28 samples of spleen and liver from rainbow trout of various sizes (70-300 g). The fish originated

from 10 different farms in North-west Poland. Ten virus strains from 3 different rainbow trout farms were

isolated in EPC. They were subsequently proved to be VHSV by means of the RT-PCR method. Semi-nested

PCR appeared to be more sensitive, since 12 samples out of 28 were identified as being VHSV positive, whereas

only 6 samples were positive using RT-PCR. Sequences of gene encoding variable glycoprotein fragments

(320 bp) of 5 randomly chosen Polish VHSV strains appeared to be identical, indicating the common origin of

VHS outbreaks in all examined rainbow trout farms. Phylogenetic analysis was performed using sequences of

one representative Polish VHSV strain and sequences of 22 strains belonging to 4 different genotypes as was

previously published. In accordance with earlier results all the VHSV strains sequences were clustered in

4 genotypes. Polish VHSV strain clustered in genotype Ia as did other continental strains of VHSV.

Keywords: VHSV, rainbow trout

*

)

Praca finansowana w ramach grantu wewnêtrznego SGGW nr 50402340011.

Medycyna Wet. 2007, 63 (9)

1121

proteinê, gen M – bia³ko matrix, gen G

– glikoproteinê, gen L – RNA polime-

razê, zaœ szósty – gen NV – koduje bia³-

ko niestrukturalne wystêpuj¹ce tylko

w zaka¿onej komórce, którego rola do

tej pory nie zosta³a wyjaœniona (2, 15).

Niezwykle istotn¹ rolê w patogene-

zie VHS odgrywa glikoproteina, która

umo¿liwia przyleganie i wnikanie wi-

rusa do komórek oraz stymuluje odpo-

wiedŸ immunologiczn¹ zaka¿onego

gospodarza, stanowi¹c g³ówny antygen

indukuj¹cy produkcjê przeciwcia³ neu-

tralizuj¹cych (3, 4). W zwi¹zku z tym gen G jest wy-

korzystywany do analizy filogenetycznej umo¿liwia-

j¹cej porównanie stopnia genetycznego pokrewieñstwa

pomiêdzy izolatami VHSV, co jest niezwykle istotne

z punktu widzenia prowadzenia dochodzenia epi-

zootycznego oraz lepszego zrozumienia biologii tego

wirusa. Analiza filogenetyczna sekwencji genu G 62

szczepów VHSV pozwoli³a na wyró¿nienie czterech

genotypów wirusa koreluj¹cych z geograficznym po-

chodzeniem badanych izolatów, ale nie z gatunkiem

ryb, od których je wyizolowano (8). Szczepy pocho-

dz¹ce od ryb morskich pojawi³y siê we wszystkich

czterech genotypach, natomiast izolaty od ryb s³odko-

wodnych nale¿a³y do genotypu I. Genotyp I charakte-

ryzuje siê najwiêksz¹ zmiennoœci¹ i w zwi¹zku z tym

wyodrêbniono w nim dodatkowe podgrupy. Badania

przeprowadzone przez Einer-Jensen i wsp. (8) wyka-

za³y, ¿e szczepy morskie VHSV adaptowa³y siê do

pstr¹ga têczowego najprawdopodobniej kilkakrotnie

w ci¹gu ostatnich 50 lat, wci¹¿ stanowi¹c potencjalne

zagro¿enie dla hodowli ryb s³odkowodnych.

Celem badañ by³o opracowanie czu³ego testu do

wykrywania zaka¿eñ VHSV u ryb chorych i nosicieli

oraz przeprowadzenie analizy filogenetycznej polskich

szczepów VHSV.

Materia³ i metody

Ryby. Przebadania przeprowadzono na 28 próbkach po-

branych od pstr¹gów têczowych o masie od 70 do 300 g.

Ryby pochodzi³y z 10 gospodarstw pstr¹gowych z terenu

pó³nocno-zachodniej Polski. Objawy kliniczne ostrego VHS

wykazywa³y ryby z gospodarstw numer 1, 3, i 4. Ryby

z pozosta³ych gospodarstw nie wykazywa³y ¿adnych obja-

wów klinicznych. Czêœæ fragmentów œledziony i nerki za-

wieszano w 1 ml odczynnika Tizol

TM

(Invitrogen), a czêœæ

w p³ynie transportowym (p³yn lubelski) w stosunku 1 : 5

w celu izolacji RNA i izolacji wirusa w hodowli komórko-

wej. Nastêpnie pobrane próbki przechowywano w –20°C

do czasu wykonania odpowiedniego badania.

Hodowle komórkowe i referencyjne szczepy wiruso-

we. Izolacjê i namna¿anie terenowych i referencyjnych

szczepów VHSV przeprowadzano w temperaturze 15°C

w hodowli komórek nab³onka karpia (EPC, epithelioma

papulosum cyprini) Hodowlê EPC uzyskano dziêki uprzej-

moœci dr Olgi L.M. Haenen z holenderskiego referencyj-

nego laboratorium chorób ryb w Lelystad. Szczepy stan-

dardowe VHSV: DK-F1 i DK-3592B oraz IHNV 32/87

uzyskano dziêki uprzejmoœci dr. Nielsa J. Olesena z refe-

rencyjnego laboratorium chorób ryb UE w Arhus, Dania.

Izolacja RNA. Ca³kowite RNA z próbek zawieszonych

w odczynniku Trizol

TM

izolowano wg zaleceñ producenta

i zawieszano w 20-40 µl wody wolnej od RNaz. Analizê

iloœci i jakoœci uzyskanego RNA przeprowadzano przy

pomocy spektrofotometru Termo Spectronic (Biometra

GmbH).

RT-PCR i semi-nested PCR. Reakcjê jednostopniowe-

go RT-PCR przeprowadzano w aparacie TGradient (Bio-

metra) w warunkach przedstawionych w tab. 1. W sk³ad

mieszaniny reakcyjnej wchodzi³y: 1 µg badanego RNA,

1 µl 10 mM starterów VHSP1 i VHSP2 (tab. 1), 1 µl

10 mM dNTP (Sigma), 1 U Taq polimerazy (Fermentas),

100 U odwrotnej transkryptazy MMLV (Promega) oraz

bufor dla MMLV. Ca³oœæ uzupe³niano wod¹ do objêtoœci

25 µl. Reakcjê semi-nested PCR przeprowadzano przy u¿y-

ciu 1 µl 10 mM starterów VHSP1 i VHSP3 w warunkach

przedstawionych w tabeli 1. Ponadto w sk³ad mieszaniny

reakcyjnej wchodzi³y: 1 µl DNA, 1 µl 10 mM dNTP, 1 U

Taq polimerazy (Fermentas) oraz bufor dla polimerazy.

Ca³oœæ uzupe³niano wod¹ do objêtoœci 50 µl. Kontrolê po-

zytywn¹ RT-PCR oraz nPCR stanowi³y referencyjne szcze-

py VHSV: DK-F1 i DK-3592B, zaœ kontrolê negatywn¹

referencyjny szczep IHNV 32/87 i niezaka¿ona hodowla

komórkowa. Produkty RT-PCR i nPCR analizowano na

1,5% ¿elu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny

i wykonywano dokumentacjê fotograficzn¹. Czu³oœæ testów

RT-PCR oraz semi-nested PCR okreœlono przy u¿yciu ko-

lejnych, 10-krotnych rozcieñczeñ RNA standardowego

szczepu VHSV DK-F1.

Izolacja i identyfikacja wirusa. Materia³ pobrany w celu

izolacji wirusa homogenizowano i odwirowywano przy

3000 g przez 15 min. w 4

°

C. Supernatant dodawano do

wra¿liwej na zaka¿enie hodowli komórek EPC i inkubo-

wano w 15°C przez 10 dni. Wynik uznawano za ujemny,

jeœli po wykonaniu pierwszego pasa¿u nie obserwowano

efektu cytopatycznego wywo³ywanego przez wirus. Wy-

izolowane szczepy VHSV identyfikowano przy u¿yciu tech-

niki RT-PCR.

Sekwencjonowanie i analiza filogenetyczna. Produk-

ty semi-nested PCR uzyskane po amplifikacji materia³u po-

chodz¹cego bezpoœrednio z badanych narz¹dów przygoto-

wywano do sekwencjonowania przy pomocy zestawu do

oczyszczania DNA po reakcjach enzymatycznych (DNA

Gdañsk). Uzyskany fragment sekwencjonowano w obu kie-

runkach przy u¿yciu starterów VHSP1 i VHSP3. Sekwen-

t

s

e

T

V

S

H

V

G

u

n

e

g

a

l

d

y

r

e

tr

a

t

S

ij

c

k

a

e

r

i

k

n

u

r

a

W

t

k

u

d

o

r

P

R

C

P

-

T

R

'

3

T

A

A

C

G

G

A

A

C

T

G

G

T

G

G

G

A

C

'

5

:

1

P

V

S

H

V

'

3

G

G

A

A

G

C

C

T

A

A

C

C

A

G

T

A

A

G

'

5

:

2

P

V

S

H

V

_

2

4 °

.

n

i

m

0

6

–

C

_

5

9 ° –

C

1

.

n

i

m

5

_

5

9 °

.

k

e

s

0

4

–

C

_

4

5 ° –

C

1

.

n

i

m

1

_

2

7 °

.

k

e

s

0

5

–

C

_

2

7 °

.

n

i

m

0

1

–

C

5

3 ×

z

p

9

7

6

d

e

t

s

e

n

-i

m

e

s

R

C

P

'

3

T

A

A

C

G

G

A

A

C

T

G

G

T

G

G

G

A

C

'

5

:

1

P

V

S

H

V

'

3

G

G

A

G

A

G

T

T

T

C

A

A

G

C

A

G

G

G

T

'

5

:

3

P

V

S

H

V

_

5

9 ° –

C

1

.

n

i

m

5

_

5

9 °

.

k

e

s

0

4

–

C

_

5

5 °

.

k

e

s

0

4

–

C

_

2

7 °

.

k

e

s

0

5

–

C

_

2

7 °

.

n

i

m

0

1

–

C

0

3 ×

z

p

0

2

3

Tab. 1. Startery i warunki reakcji RT-PCR i semi-nested PCR dla genu G VHSV

ü

ý

þ

ü

ý

þ

Medycyna Wet. 2007, 63 (9)

1122

cjonowanie wykonano metod¹ Sangera przy pomocy Big-

Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Bio-

systems) w aparacie AbiPrism ® 3100 Genetic Analyser.

Kontrolê sekwencjonowania stanowi³y produkty semi-

-nested PCR standardowych szczepów VHSV: DK-F1 oraz

DK-3592B. Porównanie nukleotydowej sekwencji i prze-

widywanej sekwencji aminokwasowej fragmentu genu G

polskich szczepów oraz 22 szczepów VHSV dostêpnych

w bazie danych EMBL przeprowadzono po wykluczeniu

sekwencji starterów przy u¿yciu programu Mega 2 (9). Ana-

lizie filogenetycznej poddano sekwencjê jednego reprezen-

tacyjnego szczepu polskiego oraz 22 sekwencji szczepów

bêd¹cych przedstawicielami 4 genotypów VHSV dostêp-

nych w bazie danych GenBank (tab. 2). Na podstawie wy-

branych sekwencji wyliczono dystans genetyczny oraz

skonstruowano drzewo filogenetyczne przy zastosowaniu

programu Mega 3.1 (9). Dystans genetyczny zosta³ wyli-

czony przy u¿yciu metody Tamura-Nei (12). Do konstruk-

cji drzewa filogenetycznego na podstawie badanych se-

kwencji wykorzystano metodê najwiêkszej oszczêdnoœci

(maximum parsimony, DNAPARS), najbli¿szego s¹siada

(neighbor-joining, NJ) i najwy¿szej wiarygodnoœci (maxi-

mum likelihood, DNAML). Moc wyjaœniaj¹c¹ powsta³ego

drzewa sprawdzono metod¹ bootstrap, przeprowadzaj¹c

1000 powtórzeñ.

Wyniki i omówienie

RT-PCR i seminested PCR. Przy u¿yciu techniki

jednostopniowego RT-PCR uzyskano produkt wiel-

koœci 679 pz, zaœ nPCR produkt wielkoœci 320 pz.

Obecnoœæ wybarwionego bromkiem etydyny pr¹¿ka po

reakcji RT-PCR stwierdzano przy rozcieñczeniu 10

–6

RNA szczepu DK-F1 (880 fg), zaœ w reakcji nPCR

czu³oœæ wzrasta³a 10-krotnie i widzialny na ¿elu pr¹-

¿ek pojawia³ siê przy rozcieñczeniu 10

–7

RNA tego

szczepu (88 fg) (ryc. 1). ObecnoϾ wirusowego RNA

w badanych próbkach stwierdzono w gospodarstwach

nr 1, 3 i 4 (tab. 2), natomiast w pozosta³ych 7 badanych

gospodarstwach wszystkie próbki by³y negatywne.

Izolacja i identyfikacja wirusa. Z 28 badanych pró-

bek we wra¿liwej na zaka¿enie hodowli EPC wyizo-

lowano 10 szczepów wirusa z materia³u pochodz¹ce-

go z gospodarstw 1, 3 i 4. Uzyskane szczepy zidenty-

fikowano jako VHSV przy u¿yciu techniki RT-PCR

(tab. 2).

Sekwencjonowanie i analiza filogenetyczna. Zsek-

wencjonowano produkty semi-nested PCR uzyskane

po amplifikacji materia³u pochodz¹cego bezpoœrednio

z badanych narz¹dów piêciu pstr¹gów têczowych:

dwóch z gospodarstwa nr 1 (PL11/05 i PL14/05),

dwóch z gospodarstwa nr 3 (PL20/05 i PL22/05) i jed-

nego z gospodarstwa nr 4 (PL30/05). Szczepy PL11/

05 i PL14/05 oraz PL20/05 i PL22/05 pochodzi³y od

pstr¹gów têczowych z gospodarstw znajduj¹cych siê

w miejscowoœci odpowiednio: Goœcicino i Bolszewo,

po³o¿onych na tym samym cieku wodnym. Szczep

PL30/05 pochodzi³ z innego gospodarstwa po³o¿one-

go w miejscowoœci Goœcicino. Uzyskane sekwencje

umieszczono w bazie danych GenBank pod numerem

Objaœnienia: * – próbka zbiorcza z 10 ryb;** – wszystkie wyizo-

lowane szczepy zidentyfikowano jako VHSV przy u¿yciu testu

RT-PCR

Tab. 2. Wynik RT-PCR, nPCR i izolacji wirusa w hodowli

EPC

o

w

t

s

r

a

d

o

p

s

o

G

a

b

z

c

i

L

h

c

y

n

a

d

a

b

k

e

b

ó

r

p

y

n

w

y

t

y

z

o

P

k

i

n

y

w

R

C

P

-

T

R

y

n

w

y

t

y

z

o

P

k

i

n

y

w

R

C

P

n

k

i

n

y

w

y

n

w

y

t

y

z

o

P

a

s

u

ri

w

ij

c

a

l

o

zi

*

*

C

P

E

il

w

o

d

o

h

w

1

6

2

6

5

3

5

3

5

4

4

*

*

1

1

1

1

M

1

2

3

4

5

6

7

8

679 pz

320 pz

Ryc. 1. Czu³oœæ testu RT-PCR i seminested PCR. M – marker

masy cz¹stkowej. 1 – szczep DK-F1. 2-8 – kolejne dziesiêcio-

krotnie wzrastaj¹ce rozcieñczenia RNA szczepu DK-F1

u

p

e

z

c

z

s

l

o

b

m

y

S

a

t

a

D

ij

c

a

l

o

zi

u

p

e

z

c

z

s

e

i

n

e

z

d

o

h

c

o

P

r

e

m

u

N

u

p

ê

t

s

o

d

5

0

/

0

3

-

L

P

5

0

0

2

y

w

o

z

c

ê

t

g

¹

rt

s

p

,

a

k

s

l

o

P

1

6

6

7

9

8

Q

D

4

X

-

R

F

9

9

9

1

k

a

p

u

z

c

z

s

,

a

j

c

n

a

r

F

5

5

0

7

8

4

J

A

7

2

R

-

R

F

3

9

9

1

y

w

o

z

c

ê

t

g

¹

rt

s

p

,

a

j

c

n

a

r

F

2

5

0

7

8

4

J

A

8

6

R

-

R

F

3

9

9

1

y

w

o

z

c

ê

t

g

¹

rt

s

p

,

a

j

c

n

a

r

F

4

5

0

7

8

4

J

A

1

7

-

7

0

-r

F

1

7

9

1

y

w

o

z

c

ê

t

g

¹

rt

s

p

,

a

j

c

n

a

r

F

6

1

6

6

4

5

Y

A

X

9

5

L

-

R

F

7

8

9

1

z

r

o

g

ê

w

,

a

j

c

n

a

r

F

8

1

6

6

4

5

Y

A

5

9

/

8

-

U

A

5

9

9

1

y

w

o

z

c

ê

t

g

¹

rt

s

p

,

a

ir

t

s

u

A

1

7

5

6

4

5

Y

A

H

F

B

2

6

2

I

F

-

H

C

9

9

9

1

y

w

o

z

c

ê

t

g

¹

rt

s

p

,

a

ir

a

c

j

a

w

z

S

1

7

5

6

4

5

Y

A

8

9

0

0

0

2

-

K

D

0

0

0

2

y

w

o

z

c

ê

t

g

¹

rt

s

p

,

a

i

n

a

D

4

0

6

6

4

5

Y

A

4

4

1

5

9

9

9

-

K

D

9

9

9

1

y

w

o

z

c

ê

t

g

¹

rt

s

p

,

a

i

n

a

D

2

0

6

6

4

5

Y

A

7

0

0

5

9

9

9

-

K

D

9

9

9

1

y

w

o

z

c

ê

t

g

¹

rt

s

p

,

a

i

n

a

D

1

0

6

6

4

5

Y

A

2

5

p

1

-

K

D

6

9

9

1

t

o

r

p

z

s

,

e

i

k

c

y

t³

a

B

e

z

r

o

M

6

7

5

6

4

5

Y

A

3

5

p

1

-

K

D

6

9

9

1

Ÿ

d

e

l

œ

,

e

i

k

c

y

t³

a

B

e

z

r

o

M

7

7

5

6

4

5

Y

A

5

4

0

6

-

K

D

1

9

9

1

y

w

o

z

c

ê

t

g

¹

rt

s

p

,

a

i

n

a

D

2

9

5

6

4

5

Y

A

3

2

1

5

-

K

D

8

8

9

1

y

w

o

z

c

ê

t

g

¹

rt

s

p

,

a

i

n

a

D

8

8

5

6

4

5

Y

A

1

3

1

5

-

K

D

8

8

9

1

y

w

o

z

c

ê

t

g

¹

rt

s

p

,

a

i

n

a

D

8

5

8

5

4

3

F

A

1

7

9

3

-

K

D

7

8

9

1

y

w

o

z

c

ê

t

g

¹

rt

s

p

,

a

i

n

a

D

7

8

5

6

4

5

Y

A

6

4

9

3

-

K

D

7

8

9

1

y

w

o

z

c

ê

t

g

¹

rt

s

p

,

a

i

n

a

D

6

8

5

6

4

5

Y

A

B

2

9

5

3

-

K

D

6

8

9

1

y

w

o

z

c

ê

t

g

¹

rt

s

p

,

a

i

n

a

D

4

3

1

6

6

X

4

1

-

A

V

S

-

E

S

8

9

9

1

,t

a

g

e

tt

a

K

a

n

i

n

œ

e

i

C

y

w

o

z

c

ê

t

g

¹

rt

s

p

2

2

6

6

4

5

Y

A

1

E

H

6

/

8

9

A

L

M

-

K

U

8

9

9

1

Ÿ

d

e

l

œ

,

e

n

c

o

n

³

ó

P

e

z

r

o

M

1

3

6

6

4

5

Y

A

4

9

/

0

6

8

-

K

U

4

9

9

1

t

o

b

r

u

t

,

a

j

c

o

k

z

S

8

2

6

6

4

5

Y

A

h

a

k

a

M

-

S

U

8

8

9

1

z

c

u

¿i

k

œ

o

s

o

³

,

A

S

U

7

4

7

8

2

U

Tab. 3. Dane dotycz¹ce szczepów VHSV u¿ytych do analizy

filogenetycznej

Medycyna Wet. 2007, 63 (9)

1123

dostêpu DQ897660-DQ897664. Zsekwencjonowane

jako kontrola fragmenty duñskich szczepów standar-

dowych VHSV: DK-F1 i DK-3592B by³y zgodne

z opublikowanymi wczeœniej w bazie danych Gen-

Bank. Porównano produkty nPCR po wykluczeniu sek-

wencji starterów, o d³ugoœci 282 nukleotydów (pozy-

cja od 715 do 995 nukleotydu) oraz przewidywane sek-

wencje aminokwasowe polskich szczepów i 22 szcze-

pów VHSV dostêpnych w bazie danych GenBank

(tab. 3). Wszystkie polskie badane szczepy mia³y 100%

homologiê porównywanej sekwencji. Stwierdzono, ¿e

najwiêkszy procent homologii sekwencji nukleotydo-

wej (99%) z polskimi szczepami VHSV wykazywa³

szczep FR-X4 wyizolowany w 1999 r. od szczupaka

we Francji (18). Kolejno, 98% homologii z polskimi

szczepami posiada³y szczepy: FR-R68 i FR-R27 wy-

izolowane w 1993 r. od pstr¹gów têczowych we Fran-

cji oraz szczep AU-8/95 wyizolowany w 1995 r. od

pstr¹ga têczowego w Austrii (8, 18). Stwierdzono, ¿e

ró¿nice w sekwencji nukleotydowej pomiêdzy polski-

mi szczepami VHSV a 22 szczepami z bazy danych

GenBank wynika³y z podstawieñ pojedynczych nukle-

otydów przy braku delecji i/lub insercji. Zaistnia³e ró¿-

nice w sekwencji nukleotydowej nie prowadzi³y do

zmian w przewidy-

wanej sekwencji ami-

nokwasowej w sto-

sunku do szczepów

polskich w przypad-

ku szczepu FR-X4.

W przypadku szcze-

pów FR-27 i FR-68

prowadzi³y do zmia-

ny jednego amino-

kwasu w pozycji 258,

zaœ w przypadku

szczepu AU-8/95 do

zmiany dwóch ami-

nokwasów w pozycji

258 i 290.

Uzyskane metod¹

NJ drzewo filogene-

tyczne przedstawio-

ne jest na ryc. 2. Po-

dobne wyniki uzys-

kano przy u¿yciu

metod: DNAPARS

i DNAML. Wartoœci

testu bootstrap powy-

¿ej 50 wskazuj¹ na

istotn¹ wspó³zale¿-

noϾ pogrupowanych

sekwencji. Wszyst-

kie sekwencje szcze-

pów uzyskanych

z bazy danych gru-

powa³y siê tak, jak

w opublikowanych

wczeœniej pracach, tworz¹c 4 genotypy. Szczep polski

znajdowa³ siê w grupie razem z izolatami FR-X4,

AU-8/95, CH-F1, FR-R68, FR-R27, DK-9995144,

DK-200098, DK-9995007, DK-3592B, DK-6045,

FR-07-71 w obrêbie podgrupy Ia genotypu I.

Badania przeprowadzone przez Antychowicza i wsp.

(1) wykaza³y, ¿e w Polsce 30% ryb jest bezobjawowy-

mi nosicielami VHSV. Badania te przeprowadzone

zosta³y przy pomocy tradycyjnych metod diagnostyki

wirusologicznej: izolacji wirusa w hodowli komórko-

wej, testu ELISA, a tak¿e metod biologii molekular-

nej: RT-PCR. Wykazano, ¿e najbardziej czu³ym testem

do identyfikacji bezobjawowych zaka¿eñ VHSV jest

wykrywanie wirusowego RNA w bezpoœrednio pobra-

nych narz¹dach metod¹ RT-PCR, a nastêpnie nPCR

(11). Miller i wsp. (11) opracowali test dwustopnio-

wego RT-PCR, a nastêpnie semi-nested PCR, który

umo¿liwia³ identyfikacjê podklinicznie zaka¿onych

osobników. Badania przeprowadzone na innym wiru-

sie atakuj¹cym ryby – ISAV wykaza³y, ¿e metoda jed-

nostopniowego RT-PCR by³a du¿o czulsza w porów-

naniu do dwustopniowego (10). W zwi¹zku z tym, aby

uproœciæ metodê oraz zwiêkszyæ jej czu³oœæ, w tych

badaniach opracowano test jednostopniowego RT-

Ryc. 2. Drzewo filogenetyczne skonstruowane przy pomocy metody najbli¿szego s¹siada (neighbor-

-joining, NJ), na podstawie sekwencji fragmentu V2 glikoproteiny G reprezentacyjnego szczepu

polskiego PL30/05 oraz 22 sekwencji szczepów bêd¹cych przedstawicielami 4 genotypów VHSV

dostêpnych w bazie danych GenBank

Genotyp I

Genotyp II

Genotyp III

Genotyp IV

PL30/05

FR-X4

AU-8/95

DK-200098
DK-9995144

FR-R27

FR-R68

CH-FI 262 BFH

DK-9995007

DK-6045

DK-3946

DK-3971

Fr-07-71
SE-SVA-14
UK-MLA98/6 HE1

DK-5131
DK-5123

UK-860/94

FR-L59X

DK-1p52
DK-1p53

US-Makah

100

100

84

100

100

100

50

62

99

76

72

37

90

61

66

84

82

49

40

0.01

Medycyna Wet. 2007, 63 (9)

1124

-PCR, a nastêpnie semi-nested PCR. Wykorzystane

w tej pracy startery do RT-PCR zosta³y opracowane

na podstawie porównania genu G kilkunastu szcze-

pów VHSV dostêpnych w bazie danych GenBanku tak,

aby zawiera³y maksymalnie konserwatywne sekwen-

cje. Po ich zaprojektowaniu okaza³o siê, ¿e starter

VHSP1 jest niemal¿e identyczny ze starterem V2R,

zaœ starter VHSP2 jest identyczny ze starterem V2F –

startery V2R i V2F zosta³y opisane w publikacji Thiéry

i wsp. (18). Stwierdzono, ¿e czu³oœæ opracowanych

testów jest wysoka, jednak ich przydatnoœæ do wykry-

wania bezobjawowych nosicieli wirusa powinna zo-

staæ potwierdzona badaniami przeprowadzonymi na

wiêkszej liczbie ryb.

Kolejnym celem niniejszych badañ by³a analiza fi-

logenetyczna polskich szczepów VHSV. Prowadzone

do tej pory badania dotycz¹ce ewolucji VHSV opiera-

³y siê na szczepach pochodz¹cych przede wszystkim

z Europy Zachodniej i Pó³nocnej (Francji, Danii, An-

glii i Szwecji) (8, 17, 18). Zgodnie z dostêpnymi da-

nymi piœmiennictwa niniejsza praca jest pierwsz¹,

w której analizie poddano szczepy z Polski. W zwi¹z-

ku z tym, ¿e glikoproteina VHSV jest niezwykle istot-

nym bia³kiem uczestnicz¹cym zarówno w procesie

zaka¿ania komórek, jak i indukowania produkcji prze-

ciwcia³ neutralizuj¹cych, wiêkszoœæ prac dotycz¹cych

analizy filogenetycznej szczepów VHSV opiera siê na

sekwencji tego genu (8, 13, 17, 18). Dlatego te¿, aby

dokonaæ analizy genetycznej polskich szczepów

VHSV wybrano fragment V2 glikoproteiny G, który

wg Benmasour i wsp. (4) kumuluje wiêkszoœæ muta-

cji, stanowi¹c doskona³e narzêdzie do przeprowadza-

nia dochodzenia epizootycznego pojawiaj¹cych siê

ognisk VHS.

Przeprowadzono tak¿e analizê reprezentacyjnej sek-

wencji szczepu polskiego oraz 22 sekwencji szczepów

zagranicznych, z których zdecydowana wiêkszoœæ (16)

zosta³o u¿ytych wczeœniej do analizy filogenetycznej

przez Einer-Jensen i wsp. (8). Trzy analizowane szcze-

py uzyskano od Thiéry i wsp. (18), zaœ pozosta³e trzy

badane by³y przez obu autorów. Einer-Jensen i wsp.

(8) porównywali sekwencje ca³ego genu G 62 szcze-

pów VHSV, uzyskuj¹c drzewo filogenetyczne z czte-

rema genotypami, które korelowa³y z geograficznym

pochodzeniem izolatu wirusa (8). Topologia drzewa

filogenetycznego skonstruowanego w niniejszych ba-

daniach przy u¿yciu fragmentu V2 glikoproteiny G,

pokrywa³a siê z wynikami uzyskanymi przez Einer-

-Jensen i wsp. (8), potwierdzaj¹c tym samym przydat-

noœæ tej krótkiej sekwencji do analizy ewolucji VHSV.

Stu procentowa homologia wszystkich zsekwencjo-

nowanych fragmentów genu glikoproteiny polskich

szczepów VHSV œwiadczy o wspólnym Ÿródle ognisk

VHS w badanych gospodarstwach pstr¹gowych. Ana-

liza filogenetyczna wykaza³a, ¿e reprezentacyjny pol-

ski szczep VHSV grupowa³ siê tak, jak wszystkie

szczepy tego wirusa z kontynentalnej Europy, w obrê-

bie genotypu I. Szczep ten znajdowa³ siê w obrêbie

podgrupy Ia razem z kilkoma szczepami z Francji

i ca³¹ grup¹ szczepów z Danii. Szczep PL-30/05 wy-

kazywa³ najbli¿sze pokrewieñstwo ze szczepem

FR-X4 wyizolowanym od szczupaka we Francji oraz

szczepem AU8/95 wyizolowanym od pstr¹ga têczo-

wego w Austrii, co wskazuje na wspólne pochodzenie

tych szczepów, a nie na wprowadzenie wirusa do pol-

skich gospodarstw pstr¹gowych z niezale¿nego ze-

wnêtrznego Ÿród³a. Jednak¿e w celu przeprowadzenia

dok³adnej analizy zmiennoœci polskich szczepów

VHSV konieczne s¹ badania wiêkszej liczby izolatów

pochodz¹cych z gospodarstw po³o¿onych w innych

czêœciach Polski.

Piœmiennictwo

1.Antychowicz J., Pêkala A.: Wirusowa krwotoczna posocznica (VHS) i za-

kaŸna martwica uk³adu krwiotwórczego (IHN) u ryb w Polsce i krajach euro-

pejskich. Medycyna Wet. 2002, 58, 341-343.

2.Basurco B., Benmasour A.: Distant strains of the fish rhabdovirus VHSV

maintain a sixth functional cistron which codes for a nonstructural protein of

unknown function. Virology 1995, 212, 741-745.

3.Bearzotti M., Monnier A. F., Vende P., Grosclaude J., de Kinkelin P., Ben-

mansour A.: The glycoprotein of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV):

antigenicity and role in virulence. Vet. Res. 1995, 26, 413-422.

4.Benmasour A., Basurco B., Monnier A. F., Vende P., Winton J. R., de Kinke-

lin P.: Sequence variation of the glycoprotein gene identifies three distinct

lineages within field of viral haemorrhagic septicaemia virus, a fish rhabdo-

virus. J. Gen. Virol. 1997, 78, 2837-2846.

5.Anon.: Commission Decision 2001/183/EC of 22 February 2001 laying down

the sampling plans and diagnostic methods of the detection and confirma-

tion of certain fish diseases and repealing Decision 92/532/EEC.

6.Anon.: Council Directive 91/67/EEC of 28 January 1991, concerning the

animal health conditions governing the placing on the market of aquaculture

animals and products.

7.Anon.: FAO: FISHSTAT Plus 2001.

8.Einer-Jensen K., Ahrens P., Forsberg R., Lorenzen N.: Evolution of the fish

rhabdovirus viral haemorrhagic septicaemia virus. J. Gen. Virol. 2004, 85,

1167-1179.

9.Kumar S., Tamura K., Nei M.: MEGA3: Integrated software for molecular

evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Brief. Bioinform.

2004, 5,150-163.

10.Mikalsen A. B., Teig A., Helleman A.-L., Mjaaland S., Rimstad E.: Detection

of infectious salmon anaemia virus (ISAV) by RT-PCR after cohabitant expo-

sure in Atlantic salmon Salmo salar. Dis. Aquat. Organ. 2001, 47, 175-181.

11.Miller T. A., Rapp J., Wastlhuber U., Hoffmann R. W., Enzmann P.-J.: Rapid

and sensitive reverse transcriptase-polymerase chain reaction based detec-

tion and differential diagnosis of fish pathogenic rhabdoviruses in organ sam-

ples and cultured cells. Dis. Aquat. Organ. 1998, 34, 13-20.

12.Nei M., Kumar S.: Molecular Evolution and Phylogenetics. University Press

Oxford Inc. 2000.

13.Nishizawa T., Iida H., Takano R., Isshiki T., Nakajima K., Murowa K.:

Genetic relatedness among Japanese, American and European isolates of

viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) based on partial G and P genes.

Dis. Aquat. Organ. 2002, 48, 143-148.

14.Regenmortel M. H. V. van, Fauquet C. M., Bishop D. H. L.: Virus Taxonomy.

Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.

Academic Press, San Diego 2000.

15.Schütze H., Mundt E., Mettenleiter T. C.: Complete genomic sequence of

viral hemorrhagic septicemia virus, a fish rhabdovirus. Virus Genes 1999,

19, 59-65.

16.Smail D. A.: Viral Haemorrhagic Septicaemia: Fish Diseases and Disorders.

T. 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. Cab International, New York

1999, 123-145.

17.Stone D. M., Way K., Dixon P. F.: Nucleotide sequence of the glycoprotein

gene of viral haemorrhagic septicaemia (VHS) viruses from different

geographical areas: a link between VHS in farmed fish species and viruses

isolated from North Sea cod (Gadus morhua L.). J. Gen. Virol. 1997, 78,

1319-1326.

18.Thiéry R., de Boisséson C., Jeffroy J., Castric J., de Kinkelin P., Benma-

sour A.: Phylogenetic analysis of viral haemorrhagic septicaemia virus

(VHSV) isolates from France (1971-1999). Dis. Aquat. Organ. 2002, 52,

29-37.
Adres autora: dr Aleksandra Ruszczyk, ul. Ciszewskiego 8, 02-786 War-

szawa; e-mail: [e-mail]