Laboratorium mikrobiologiczne

Cel ćwiczenia

• Zapoznanie się z regulaminem ćwiczeń
• Poznanie podstawowego szkła i sprzętu

mikrobiologicznego i sposobów sterylizacji

• Zapoznanie się rodzajami i sposobem

przygotowywania podłoży mikrobiologicznych oraz

metodami hodowli mikroorganizmów

• Mikroskopy stosowane w badaniach

mikrobiologicznych

Podstawowe szkło

• Probówki bakteriologiczne (probówki Falcone)
• Płytki (szalki) Petriego
• Kolby Roux (inne butelki)
• Kolby Erlenmayera

Sprzęt do szczepienia

• Igła bakteriologiczna
• Eza bakteriologiczna
• Głaszczka Drygalskiego
• Palnik

Sprzęt do hodowli

• Termostat
• Wytrząsarka

Sprzęt do sterylizacji

• Suszarka do sterylizacji szkła
• Autoklaw do sterylizacji podłoży

Metody sterylizacji

• Fizyczne
• Chemiczne

Metody fizyczne

• Wysoka temperaturą (sucha – wyżarzanie,

opalanie, gorące powietrze i parą wodną –

dekoktacja, pasteryzacja, tyndalizacja, para wodna

pod zwiększonym ciśnieniem - sterylizacja)

• Promienie elektromagnetyczne: UV, radiacyjne

(jonizujące)

• Sączenie

Metoda chemiczna

• Sterylizacja gazowa (tlenek etylenu w mieszaninie

CO

2

, beta-propiolakton, ozon i chlor, fluor –woda)

Kontrola sterylizacji

• Sporotesty (sporal A do autoklawów, sporal S do

suszarek np. stericon plus Bioindicator do

autoklawu zawiera przetrwalniki

Geobacillus

stearothermophilus

w fiolce 2 ml). Po

autoklawowaniu ampułki inkubuje się 48 godz. w

temp. 60± 2

o

C. Nie wysterylizowane jako kontrola.

Jeśli kolor pozostanie czerwono-fioletowy to

sterylizacja poprawna.

Dezynfekcja

• Środki chemiczne (kwasy, zasady, środki

utleniające, alkohole, aldehydy, związki fenoli i ich

pochodne, związki powierzchniowo czynne,

jodofory, chloroheksydyna, sole metali ciężkich)

• Kontrola skażenia powierzchni i powietrza

drobnoustrojami

Zastosowanie podłoży mikrobiologicznych

• Izolacja
• Różnicowanie
• Identyfikacja
• Namnażanie
• Określenie właściwości fizjologicznych,

biochemicznych i hodowlanych

Rodzaje podłoży ze względu na zawartość

składników odżywczych

• Minimalne
• Pełne
• Wzbogacone

Rodzaje podłoży ze względu na skład

chemiczny

• Naturalne
• Półsyntetyczne
• Syntetyczne

Rodzaje podłoży ze względu na konsystencję

• Stałe (zaw. 1,5-2,0% agaru)
• Półpłynne (0,1-0,7 agaru)
• Płynne
• Agar - uniwersalny środek zestalający pożywki

mikrobiologiczne (z morskich krasnorostów

Selidum amansi

)

• Żelatyna (produkt hydrolizy kolagenu)

Rodzaje podłoży ze względu na przeznaczenie

i zastosowanie

• Namnażające
• Wybiórcze
• Namnażająco-wybiórcze
• Izolacyjne
• Różnicujące (identyfikacyjne, diagnostyczne)
• Podłoża „transportowe”

Metody hodowli

•Ze względu na rodzaj podłoża:

- hodowle płynne
- hodowle na podłożu stałym

Hodowle płynne

• W probówkach
• W kolbach
• W butlach
• W fermentorach

Fermentory

Hodowle na podłożach stałych

• Na płytkach Petriego
• Słupkach
• Skosach
• W butlach

Ze względu na czas hodowli oraz dostęp

składników pokarmowych

• Hodowle okresowe (zamknięte) – czynniki

ograniczające to wyczerpanie składników

pokarmowych, nagromadzenie metabolitów i zmiana

równowagi jonowej (głównie pH)

• Hodowle otwarte (ciągłe) – ciągła kontrola zużycie

substancji odżywczych, przyrost liczby i masy

drobnoustrojów oraz stężenie metabolitów

• Hodowle zsynchronizowane – wszystkie osobniki

dzielą się jednocześnie (w tym samym czasie)

Ze względu na stosunek bakterii do tlenu

• Hodowle tlenowców
• Hodowle beztlenowców

Hodowle tlenowców

• Hodowle powierzchniowe
• Hodowle wgłębne (wytrząsarki, fermentory)

Hodowle beztlenowców

• Metody fizyczne (warstwa oleju parafinowego, słój

próżniowy, hodowla w atmosferze gazu obojętnego,

przy użyciu zestawu np. „Gas-Pak”)

• Metody chemiczne (podłoża zawierające

substancje chemiczne absorbujące tlen np.

pirogallol, chlorek miedziowy lub związki chemiczne

obniżające potencjał oksydo-redukcyjny np. kwas

askorbinowy, siarczyn sodowy)

• Metody biologiczne – hodowla na tym samym

podłożu tlenowca i beztlenowca

Mikroskopy do obserwacji mikrobiologicznych

• Świetlny
• Z ciemnym polem widzenia
• Kontrastowo-fazowy
• Ultrafioletowy
• Fluorescencyjny
• Polaryzacyjno-interferencyjny
• Elektronowy transmisyjny
• Skaningowy

Mikroskop świetlny

• Najważniejsze pojęcia dla mikrobiologa to powiększenie

mikroskopu i zdolność rozdzielcza

• Powiększeniem mikroskopu to stosunek obrazu pozornego A

”

,

który widzimy w mikroskopie do wielkości przedmiotu

(iloczyn powiększenia okularu i powiększenia obiektywu)

• Zdolność rozdzielcza (najmniejsza odległość pomiędzy

dwoma punktami, przy której widzimy je w mikroskopie

oddzielnie)

• Olejek immersyjny pozwala zwiększyć zdolność rozdzielczą

mikroskopu do 0,19 mikrometra zwiększając aperturę

liczbową obiektywu (suchy – 0,3 mikrometra, „wodny” – 0,24

mikrometra)

• Zastosowanie odpowiednich filtrów lub światła UV może

zwiększyć zdolność rozdzielczą do 0,17 mikrometra

Mikroskop z ciemny polem widzenia

• Pole widzenia ciemne, a obserwowane obiekty –

jasne (kondensor ciemnego pola)

• Stosowany olejek immersyjny (górna soczewka

kondensora a dolna pow. preparatu)

• Zdolność rozdzielcza podobna jak w mikroskopie

świetlnym

• Obserwacje żywych bakterii

krętki

Mikroskop kontrastowo-fazowy

• Bezbarwne obiekty fazowe (przezroczyste)

przekształcane są w obiekty amplitudowe

powodujące zmiany natężenia światła widoczne dla

oka przy zastosowaniu płytki fazowej

• Umożliwia obserwacje żywych bakterii a w

szczególności ich ruchu (bez wybarwiania)

komórki
drożdży

Mikroskop ultrafioletowy

• Stosowane są lampy rtęciowo-kwarcowe
• Poprzez zastosowanie światła UV ( o krótszej fali)

zwiększona została zdolność rozdzielcza do 0,1

mikrometra

dwie kolonie

Streptomyces sp.

Mikroskop fluorescencyjny (luminescencyjny)

• Wykorzystywane zjawisko pobudzania świecenia

preparatów oświetlanych promieniami

ultrafioletowymi po wybarwieniu fluorochromami

(barwniki wysyłające światło o długiej fali po

wzbudzeniu promieniami UV) np. erytrozyną,

oranżem akrydynowym, rodaminą

bakterie
z fluoryzującym
na zielono
białkiem

Mikroskop polaryzacyjno-interferencyjny

• Służy do obserwacji przezroczystych i

pochłaniających światło obiektów

• Zastosowany pryzmat, polaryzator i analizator
• Oglądany przedmiot robi wrażenie przestrzennego

Inne mikroskopy

• Mikroskop elektronowy – transmisyjny (wykorzystywane są

trzy elektromagnesy i wiązka elektronów a obraz

przekazywany jest na ekran lub kliszę fotograficzną),

zdolność rozdzielcza 4-10 Å, siatki platynowe zamiast

szkiełka podstawowego, preparaty bardzo cienkie do 0,5

mikrometra, obraz trójwymiarowy

• Mikroskop skaningowy (elektrony przechodzą przez cały

preparat a powstały obraz może być fotografowany lub

obserwowany na monitorze) obraz trójwymiarowy, zdolność

rozdzielcza 0,02 mikrometra, obserwacja bakterii i ich

penetracji w komórkach gospodarza

Obrazy z mikroskopu transmisyjnego

Salmonella sp.

pączkujące drożdże(przekrój)

Obrazy z mikroskopu skaningowego

Enterococcus faecalis

Bacillus anthrax

Typ mikroskopu

Oświetlenie
preparatu

Obraz

Zdolność
rozdzielcza

Powiększenia

świetlny

światło
widzialne

światło widzialne
(okular)

0.2 μm

5–1 500 x

fluorescencyjny

ultrafiolet

światło widzialne
(okular)

0.2 μm

5–1 500 x

elektronowy
transmisyjny

strumień
elektronów

światło widzialne
(ekran fluoresc.)

0.2- 1 nm

1000-500 000

elektronowy
skaningowy

strumień
elektronów

elektroniczny
(monitor)

3-10 nm

100-50 000 x

tunelowy

prąd
elektryczny

elektroniczny
(monitor)

001-0.1 nm

10 000 000 x