Profil transkrypcji – metoda

SAGE; białka struktura i funkcja

SAGE
Serial analysis of Gene Expression

Materiał wyjściowy: mRNA z polyA
1. Annealing do sekwencji poly dT

związanej z biotyną

2. Synteza cDNA
3. Trawienie enzymem restrykcyjnym

(kotwiczącym, AE)

4. Ligacja dwóch typów sekwencji

zawierających sekwencję „tagging
enzyme” (TE)

5. Cięcie enzymem TE
6. Łączenie krótkich sekwencji tag w

ditagi

7. Multiplikacja ditagów za pomocą

PCR

8. Odcięcie sekwencji TE i

końcowych sekwencji starterowych

9. Ligacja wielu ditagów i ich

klonowanie

10.Sekwencjonowanie klonów

SAGE – Serial Analysis of Gene Expression

SAGE pozwala na detekcję

sekwencji nukleotydowych

poszczególnych genów w próbce

i analizę ilościową ekspresji

genów w komórkach

1. Biotynylowane oligo(dT) jest starterem do
syntezy cDNA. cDNA jest izolowane przez
przyłączenie do granulek związanych ze
streptawidyną

2. Restryktaza rozpoznająca
sekwencje 4pz przecina każdy odcinek
cDNA przynajmniej w jednym
miejscu

3. Ligacja fragmentów
zawierających miejsca
restrykcyjne dla enzymu
typu IIS i łączenie ditagów

Produkty PCR zawierają
ditagi powiązane z
sekwencjami łącznikowymi

Analiza sekwencyjna otrzymanych

konkatemerów pozwala na porównanie

i ewentualną identyfikacje wieluset

transkrybowanych sekwencji

a także wykrywanie nowych genów

4. Powstale przez konkatemeryzację ditagów klony zawierają co najmniej 10-50
fragmentów (tags)

Przechowywanie i namnażanie sekwencji genomowych

badanie sekwencji kodujących i niekodujących

Namnażanie cDNA (transkrypty)

badanie sekwencji transkrybowanych
wykrywanie rzadkich transkryptów

Ekspresja genów – poziom transkrypcji

Podstawowe zadanie biologii molekularnej to badanie

funkcji jaką pełnią różne sekwencje nukleotydowe i białka;

poznawanie mechanizmów regulujących procesy życiowe

komórek i organizmów.

Metody klonowania genów i PCR pozwalają na:

Badanie struktury i funkcji białek

oczyszczanie i charakterystyka
oddziaływania białko – DNA, białko-białko
ekspresja i modyfikacje w różnych typach
komórek

Białka

Regulacja transkrypcji
Regulacja translacji
Procesy metaboliczne

Białka
składają się z aminokwasów
połączonych wiązaniem peptydowym

Wiązanie peptydowe tworzy się
między grupami COOH i NH

kolejnych aminokwasów

aminokwas

1.Kowalencyjna modyfikacja
a: wiązania peptydowego
b: końca N
c: końca C
d: reszt aminokwasowych (łańcuchów bocznych).
2. Modyfikacje niekowalencyjne: zmiana konformacji, reakcja z kofaktorami
3. Translokacja: selekcja przedziału komórkowego
4. Oddziaływanie z białkami opiekuńczymi w procesach 1, 2, i 3.

Modyfikacje białek powodują

•Nabycie lub utratę funkcji
•Zmianę swoistości oddziaływania z innymi białkami
•Regulację aktywności
•Zmianę biologicznej stabilności

Modyfikacje potranslacyjne białek