Metody oznaczania liczby drobnoustrojów (ćwiczenie 3)
Liczbę mikroorganizmów występujących w danym środowisku można określić
różnymi metodami. Powszechnie stosowane metody dzielą się na bezpośrednie i
pośrednie. Metody bezpośrednie służą do oznaczania sumy żywych i martwych
komórek. Metody pośrednie (hodowlane) opierają się na obserwacji wzrostu żywych
komórek.
·ð BezpoÅ›rednie metody oznaczania liczby drobnoustrojów:
Oznaczanie liczby komórek w polu widzenia mikroskopu. Sposób postępowania:
o na środku szkiełka podstawowego wyznacza się flamastrem kwadrat o boku
10 mm;
o na wyznaczonÄ… powierzchniÄ™ przenosi siÄ™ mikropipetÄ… 0,01cm3 badanej
zawiesiny bakterii i równomiernie rozprowadzacza po powierzchni;
o preparat suszy się i utrwala, zabarwia błękitem metylenowym (1-2 min), a
następnie spłukuje wodą i suszy;
o liczbę komórek liczy się w 20 polach widzenia mikroskopu (powiększenie
1000x), po wyliczeniu średniej uzyskane dane podstawia się do wzoru:
Obliczanie wg wzoru: A = N x 4 x 104 / Ä„d2; gdzie:
A  liczba komórek;
N  średnia liczba bakterii w jednym polu widzenia
d  średnica pola widzenia [mm]
Objaśnienie obliczeń:
Åšrednica pola widzenia mikroskopu d = 0,16 mm
Powierzchnia pola widzenia Ä„r2 = 3,14 (0,08)2 = 0,02 mm2
Powierzchnia rozmazu 10 x 10 = 100 mm2
Jedno pole widzenia reprezentuje 1/5000 część powierzchni rozmazu,
która wynosi 0,01 cm3.
Jedna komórka w polu widzenia odpowiada 5.000 komórek w objętości
0,01 cm3 lub 500.000 komórek w objętości 1 cm3.
Komory - służą do bezpośredniego liczenia drobnoustrojów pod mikroskopem.
·ð Komora Thoma (hemocytometr)  szklana pÅ‚ytka z 2 wgÅ‚Ä™bieniami (gÅ‚Ä™bokość
0,1 mm) i naniesioną siatką podzieloną na 16 dużych kwadratów .Każdy z tych
kwadratów składa się z 16 małych kwadracików o boku 0,05 mm i objętości
pod szkiełkiem nakrywkowym 1/4000 mm3.
Rys.1. Komora Thoma
·ð Komora Bürkera - szklana pÅ‚ytka z 2 wgÅ‚Ä™bieniami (0,1 mm) i siatkÄ…
podzieloną na kwadraciki o boku 0,2 mm, powierzchni 0,04 mm2 i objętości
pod szkiełkiem nakrywkowym 0,004 mm3;
·ð Komora Howarda  szklana, gruba pÅ‚ytka z wyżłobionym doÅ‚kiem o
głębokości 0,1 mm, który przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym,
posiadajÄ…cym 25 przez
roczystych pól o średnicy 1,382 mm. Stosowana w
analizach obecności grzybów pleśniowych w sokach.
Oznaczanie liczby komórek przy użyciu komory Thoma.
Komora Thoma jest wykorzystywana do liczenia komórek o wymiarach większych
niż 0,4 mm, czyli drożdży, zarodników i fragmentów strzępek grzybów. Komora
ma naniesioną siatkę 16 dużych kwadratów, z których każdy zawiera 16 małych
kwadracików o boku 0,05 mm (o powierzchni 1/400 mm2 i objętości 1/4000 mm3).
Badany materiał nanosi się na komorę, przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i liczy
pod mikroskopem przy powiększeniu 400x. Dla wiarygodnego wyniku należy
policzyć komórki zgodnie z załączonym schematem w 40-80 małych kwadratach.
Aby błąd obliczeń nie przekroczył 10% należy zliczyć co najmniej 700 komórek.
Obliczanie przeprowadza się według wzoru:
N = 4 x 106 x aśr x r
aśr  średnia liczba komórek w małym kwadracie
r  rozcieńczenie badanej próbki.
Rys. 2. Sposób liczenia komórek w komorze